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【技术贴】引物设计究竟该怎么设计？才能保证在PCR芯片或qPCR实验中的特异性！
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在荧光定量PCR实验中，引物至关重要，设计的成功与否，关乎整个实验的成败。各位站友在进行qPCR实验时遇到的各种问题，也往往由引物设计不当引起。我们是研发PCR芯片的团队，对qPCR实验中引物设计有独特的见解和解决方法，现在与大家来分享，希望对大家的实验有所帮助！ 以往的荧光定量PCR中引物设计都基于以下几个原则： • 引物的 GC 含量为 50–60% • 熔解温度(Tm) 在 50ºC-65ºC 之间 • 避免产生二级结构，必要时引物结合位置设计在目标序列二级结构区域之外 • 避免超过 3 个 G 或 C 重复片段 • 引物末端碱基为 G 或 C • 检查正向和反向引物确保 3' 没有互补配对（避免引物二聚体形成） • 用BLAST等软件来检验引物的特异性 以上都是必须满足的条件，但如果要在更多的实验样本中实现扩增结果的特异性和一致性，我们发现这些要素并不能很好的解决所有问题，就要再引入独特的设计理念。 我们的独特的引物设计理念总结如下： a. 引物设计涵盖该基因的所有转录本，完整定量一个基因的表达； b. 引物不含SNP位点，不会因为个体基因多样性而导致定量差别； c. 引物不会位于基因组重复序列内； d. 引物专一性得到BLAST分析的验证，绝大多数引物在目标序列与非目标序列相差3个碱基以上； e. 绝大多数引物设计跨越剪接区域，只扩增成熟mRNA，极大程度避免RNA样品中残余基因组DNA对体系的影响； f. 建立引物数据库，统计每对引物Tm值的置信区间，以监控引物是否正常运行。 简单说来，①. b, c, d等原则是为了保证引物在大量样本中的特异性；②. a, e, f等原则是为了保证引物在大量样本中的一致性。 希望我们的这些信息对大家的实验有所帮助！欢迎大家与我讨论相关问题，或将问题发到我的邮箱tangchen@ctbioscience.com（江苏楚天生物）。 |
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