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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » FFPE样本提取DNA后分光光度计和Qubit3.0浓度测定差别为何如此之大？
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hcf321283

木虫 (小有名气)

[求助] FFPE样本提取DNA后分光光度计和Qubit3.0浓度测定差别为何如此之大？ 已有2人参与

如题
最近做实验需用到FFPE样本DNA，但是分别用两种检测方法测定浓度后发现差别太过诡异。可有大神帮忙解惑，感激不尽！
如图：前一列为分光光度计测定的浓度，后一列为Qubit3.0测定的浓度。

FFPE样本提取DNA后分光光度计和Qubit3.0浓度测定差别为何如此之大？
浓度对比表.png
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1楼 2016-03-23 10:23:15
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hcf321283

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaoyang636 at 2016-03-23 12:36:41
我认为这两种方法差别明显的原因有如下几点：
1. FFPE降解，DNA片段化严重，存在大量寡聚核苷酸，甚至单核苷酸，Nanodrop有读数，偏高，Qubit基于染料法，对这钟寡聚核苷酸基本不能定量，读数偏低。（主要原因）
...

这是我用琼脂糖跑的电泳，FFPE基本片段化很严重。
FFPE样本提取DNA后分光光度计和Qubit3.0浓度测定差别为何如此之大？-1
电泳图
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3楼2016-03-24 09:36:24
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gaoyang636

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hcf321283: 金币+15, ★★★★★最佳答案 2016-03-24 14:29:54
我认为这两种方法差别明显的原因有如下几点：
1. FFPE降解，DNA片段化严重，存在大量寡聚核苷酸，甚至单核苷酸，Nanodrop有读数，偏高，Qubit基于染料法，对这钟寡聚核苷酸基本不能定量，读数偏低。（主要原因）
2. RNA残留。
3. 提取DNA溶液里含有较高比例的杂质，导致有吸光读数，比如苯酚残留。

如果想进一步确定一下原因，可以跑一个片段分析看看
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2楼2016-03-23 12:36:41
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a314919473

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hcf321283: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-03-24 14:30:02
我们公司也有这两台仪器，但是差距没这么大。
如2楼所说，我建议你重新测量，测个空白对照，看看仪器灵敏度
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有你真好
4楼2016-03-24 09:45:12
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半天云

新虫 (初入文坛)
这种情况有很正常，如果你的A260/280在1.7--1.9之间，那么差别就不会很大，另外如楼上所说，FFPE降解严重，片段化较多，请问你提取的FFPE 是做什么用
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5楼2017-07-18 17:02:42
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