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hcf321283

木虫 (小有名气)

[求助] FFPE样本提取DNA后分光光度计和Qubit3.0浓度测定差别为何如此之大? 已有2人参与

如题
最近做实验需用到FFPE样本DNA,但是分别用两种检测方法测定浓度后发现差别太过诡异。可有大神帮忙解惑,感激不尽!
如图:前一列为分光光度计测定的浓度,后一列为Qubit3.0测定的浓度。

FFPE样本提取DNA后分光光度计和Qubit3.0浓度测定差别为何如此之大?
浓度对比表.png
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gaoyang636

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
hcf321283: 金币+15, ★★★★★最佳答案 2016-03-24 14:29:54
我认为这两种方法差别明显的原因有如下几点:
1. FFPE降解,DNA片段化严重,存在大量寡聚核苷酸,甚至单核苷酸,Nanodrop有读数,偏高,Qubit基于染料法,对这钟寡聚核苷酸基本不能定量,读数偏低。(主要原因)
2. RNA残留。
3. 提取DNA溶液里含有较高比例的杂质,导致有吸光读数,比如苯酚残留。

如果想进一步确定一下原因,可以跑一个片段分析看看
2楼2016-03-23 12:36:41
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hcf321283

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gaoyang636 at 2016-03-23 12:36:41
我认为这两种方法差别明显的原因有如下几点:
1. FFPE降解,DNA片段化严重,存在大量寡聚核苷酸,甚至单核苷酸,Nanodrop有读数,偏高,Qubit基于染料法,对这钟寡聚核苷酸基本不能定量,读数偏低。(主要原因)
...

这是我用琼脂糖跑的电泳,FFPE基本片段化很严重。
FFPE样本提取DNA后分光光度计和Qubit3.0浓度测定差别为何如此之大?-1
电泳图

3楼2016-03-24 09:36:24
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a314919473

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
hcf321283: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-03-24 14:30:02
我们公司也有这两台仪器,但是差距没这么大。
如2楼所说,我建议你重新测量,测个空白对照,看看仪器灵敏度
有你真好
4楼2016-03-24 09:45:12
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半天云

新虫 (初入文坛)

这种情况有很正常,如果你的A260/280在1.7--1.9之间,那么差别就不会很大,另外如楼上所说,FFPE降解严重,片段化较多,请问你提取的FFPE 是做什么用
5楼2017-07-18 17:02:42
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