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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助关于定点突变 去甲基化之后电泳无条带 转化无斑
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zliean

金虫 (小有名气)

[求助] 求助关于定点突变 去甲基化之后电泳无条带 转化无斑 已有1人参与

现在不确定是不是载体出了问题，我从头开始说吧
1.去年开始做定点突变，目的片段链接pET-28a 转化到jm109进行甲基化，提取质粒用全式金试剂盒先进行PCR 然后用去甲基化酶消化，转化到BL21，验证位点都很顺利。
2.年末发现目的片段有一些问题 然后在目的片段两段加了Sal 1和Xho 1 位点连接了pET-21b 转化到jm109 都很顺利
3.问题来了，提取的质粒条带和以前提取的质粒条带不一样（下附图，左侧三个），突变PCR后有条带，去甲基化消化一小时后电泳 没有条带了 正常应该是有的，然后转化也没有斑，
从头到尾只是增加了两个酶切位点 换了载体 ，但是这些和去甲基化酶消化的位点不冲突，想问问有没有做过的 给解答下   万分感谢！！！

求助关于定点突变 去甲基化之后电泳无条带 转化无斑
3.20.jpg
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1楼 2016-03-20 09:31:04
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star013

新虫 (知名作家)
我们可以帮您做甲基化

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3楼2016-03-20 10:01:15
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zliean: 金币+5 2016-03-28 10:55:14
去甲基化我不太了解，只是你对比两次质粒不一样是怎么对比的，做pcr？还是做酶切？

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
2楼2016-03-20 09:57:05
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zliean

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-20 09:57:05
去甲基化我不太了解，只是你对比两次质粒不一样是怎么对比的，做pcr？还是做酶切？

是提取质粒跑胶的形态不一样，之前跑质粒很正常的三条带 中间最亮，现在是三条带 下面最亮 这能不能说明质粒有问题啊 康宁试剂盒 没换过

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4楼2016-03-20 10:44:19
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by zliean at 2016-03-20 10:44:19
是提取质粒跑胶的形态不一样，之前跑质粒很正常的三条带 中间最亮，现在是三条带 下面最亮 这能不能说明质粒有问题啊 康宁试剂盒 没换过
...

通过这个我是不能得出这个结论，你两次抽提的质粒浓度本身浓度就差很多，想看正不正常，还是需要而且必须做酶切才可以判断。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
5楼2016-03-20 11:18:41
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