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山脚下的喵

新虫 (小有名气)

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[求助] southern探针合成方法的优劣已有1人参与

请问，southern杂交，用了地高辛试剂盒。说明书中探针合成是先PCR，再加标记（方法一）。但我看见有人直接在PCR时把染料放进去了（方法二）。
问题一：请问这两种方法有什么优劣么？
问题二：第二种方法是把什么染料放进去的呀，是用的什么试剂盒呢？
谢谢大家的帮助。

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高山自有方便路，远水自有渡河人？

1楼 2016-03-18 10:10:59

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coofir

铜虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
山脚下的喵: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-04-08 21:02:06

最近也在学southern blot，在网上查资料看到这么说：
1. 1. 1 　PCR 掺入法　
      这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq 酶的作用下，将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。少量的基因组DNA(1ng～50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。
1. 1. 2 　随机引物法　

      用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。为得到最佳标记效果，标记前模板DNA 需作线性处理，而且至少要用苯酚-氯仿进行一次抽提，再用乙醇沉淀。 100～10000 碱基的模板链均可被有效地标记，但大于10000 碱基的模板链则需要在标记前作限制酶切消化。处理好的模板加入随机引物，按碱基互补原则，随机引物与模板DNA 退火后由Klenow 片段从引物3' 端延伸引物，便可将DIG-11-dUTP 均匀掺入到新合成的DNA 链中。
1. 1. 3 　切口平移法　

      切口平移法DNA 探针技术快速简便，且已非常成熟。先用适量的DNase I 在双链DNA 上打开若干个单链缺口，然后在E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 外切活性和聚合活性的共同作用下，在缺口的5' 端切除单链DNA 序列，随之由新合成的带有地高辛标记的脱氧核苷酸链取代。

      本法适用于环形DNA 或大于1kb DNA 片段的标记。用于原位杂交的核酸探针，通过切口平移法标记最为有效。因为此方法可通过控制DNase I 的酶活性得到适当的缺口，从而得到长度大小适宜的探针，而探针的大小是原位杂交的一个重要参数，足够小的探针才可能穿透组织或细胞。

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