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喵喵小猫鱼

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物测序后发现有片段丢失 已有5人参与

我做PCR，将回收的产物连接载体测序后发现：我的目的片段（~150bp）两端引物部分的序列都是对的，但是引物之间的部分基本都丢失了，只剩下十几个bp，想知道是什么原因，请大家指教。
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1楼 2016-03-15 20:04:27
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物之间只剩几十bp？你确定是你的目的片段丢失，而不是根本就没有连上目的片段么？建议你分析一下引物之间那几十bp，看看是不是多克隆位点。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
2楼2016-03-15 20:07:50
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喵喵小猫鱼

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-15 20:07:50
引物之间只剩几十bp？你确定是你的目的片段丢失，而不是根本就没有连上目的片段么？建议你分析一下引物之间那几十bp，看看是不是多克隆位点。

并没有多克隆位点，而且我从模板上克隆目的片段后的电泳结果条带挺好的，不知道为什么，测序出来就没有了

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3楼2016-03-15 20:29:08
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-15 20:07:50
引物之间只剩几十bp？你确定是你的目的片段丢失，而不是根本就没有连上目的片段么？建议你分析一下引物之间那几十bp，看看是不是多克隆位点。

从模板上克隆挺好的，是什么意思？指你的PCR获得的目的产物么？

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
4楼2016-03-15 20:35:40
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喵喵小猫鱼

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-15 20:35:40
从模板上克隆挺好的，是什么意思？指你的PCR获得的目的产物么？
...

就是pcr之后跑电泳，条带的大小是符合预期的

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5楼2016-03-15 20:43:39
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 喵喵小猫鱼 at 2016-03-15 20:43:39
就是pcr之后跑电泳，条带的大小是符合预期的
...

这个pcr，是连接转化后，挑取的单菌落进行pcr验证的？

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6楼2016-03-15 21:09:57
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连接载体后需要做菌落PCR初步验证目的条带大小，然后选择正确大小条带的送样测序。
测序公司测序过程中会出现这样的问题，可要求免费重测。
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7楼2016-03-15 21:11:32
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喵喵小猫鱼

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-15 21:09:57
这个pcr，是连接转化后，挑取的单菌落进行pcr验证的？
...

从克隆目的片段到菌落pcr，每一步的电泳结果都是符合预期的

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8楼2016-03-15 21:51:51
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喵喵小猫鱼

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-15 21:11:32
连接载体后需要做菌落PCR初步验证目的条带大小，然后选择正确大小条带的送样测序。
测序公司测序过程中会出现这样的问题，可要求免费重测。

应该不是公司测序的问题，因为第二次重新连接载体转化后再次提质粒测序，结果还是有问题，引物之间的片段还是不对

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9楼2016-03-15 21:54:23
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xuanrufeng

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我曾经也遇到这情况  目的片段P出来的片段少了100多bp  送去测序发现的确是片段中间丢失了100多bp 至今没搞清楚什么原因导致的
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本性难移
10楼2016-03-17 08:52:18
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