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原核表达问题 已有2人参与
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| 我用pET-28a做表达载体，BL21（DE3）做宿主表达出的目的蛋白有活性，但是大小比预测小了十几个KD啊啊啊？谁能告诉我这是什么情况？有谁遇到过吗？ |
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 虫友问答-分子生物 |
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3楼2016-03-15 16:53:50
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首先，你要确定你的蛋白大小是多少； 其次，你说少了十几kd，那这个带你测序了吗？你怎么就说它是你的目的带呢？测序才能知道是不是你的目的带啊，SDS-PAGR肉眼判断不是完全正确的，有时候胶浓度等原因都会造成或大或小，当然少十几kd应该是不会的； 第三，那个你认为少了十几kd的条带不是你的目的带，你的目的条带或者因为表达量低或是没有表达，所以在SDS-PAGE上看不出来，所以这时候你可以做个Western blot检测一下，WB较灵敏也许可以看出来。 第四，你跑的这个样是上清还是沉淀呢，你的蛋白表达可能不在上清，上清就没有，那就在沉淀中，所以我也不知道你跑的是上清还是沉淀，沉淀就是包涵体了； 如果那个少了十几kd的条带经过鉴定不是你的目的带的话，那就是你的蛋白没有表达了，那这就是另一个问题了，蛋白不表达原因有很多，从基因到构建质粒到宿主菌选择到表达条件优化等等，还有表达不在上清在包涵体的情况， 提供资料：原核表达FAQ，个人实验经验总结主要针对蛋白不表达和蛋白表达为什么不在上清进行分析并提出可实施的方案：http://www.detaibio.com/topics/yuan-he-biao-da-faq.html 希望有帮助！ |
2楼2016-03-15 16:06:45
原海亮
木虫 (著名写手)
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- 注册: 2011-09-06
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
4楼2016-03-15 20:12:50