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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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紫漠清扬

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达问题 已有2人参与

我用pET-28a做表达载体，BL21（DE3）做宿主表达出的目的蛋白有活性，但是大小比预测小了十几个KD啊啊啊？谁能告诉我这是什么情况？有谁遇到过吗？
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1楼 2016-03-15 15:29:17
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MarchZR

银虫 (小有名气)
首先，你要确定你的蛋白大小是多少；
其次，你说少了十几kd，那这个带你测序了吗？你怎么就说它是你的目的带呢？测序才能知道是不是你的目的带啊，SDS-PAGR肉眼判断不是完全正确的，有时候胶浓度等原因都会造成或大或小，当然少十几kd应该是不会的；
第三，那个你认为少了十几kd的条带不是你的目的带，你的目的条带或者因为表达量低或是没有表达，所以在SDS-PAGE上看不出来，所以这时候你可以做个Western blot检测一下，WB较灵敏也许可以看出来。
第四，你跑的这个样是上清还是沉淀呢，你的蛋白表达可能不在上清，上清就没有，那就在沉淀中，所以我也不知道你跑的是上清还是沉淀，沉淀就是包涵体了；

如果那个少了十几kd的条带经过鉴定不是你的目的带的话，那就是你的蛋白没有表达了，那这就是另一个问题了，蛋白不表达原因有很多，从基因到构建质粒到宿主菌选择到表达条件优化等等，还有表达不在上清在包涵体的情况，
提供资料：原核表达FAQ，个人实验经验总结主要针对蛋白不表达和蛋白表达为什么不在上清进行分析并提出可实施的方案：http://www.detaibio.com/topics/yuan-he-biao-da-faq.html
希望有帮助！
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2楼2016-03-15 16:06:45
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紫漠清扬

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by MarchZR at 2016-03-15 16:06:45
首先，你要确定你的蛋白大小是多少；
其次，你说少了十几kd，那这个带你测序了吗？你怎么就说它是你的目的带呢？测序才能知道是不是你的目的带啊，SDS-PAGR肉眼判断不是完全正确的，有时候胶浓度等原因都会造成或大 ...

谢谢您的应助，我是用ExPASy网站上的ProParam程序预测的蛋白大小，SDS-PAGE沉淀和上清都跑了，与对照相比有明显积累的条带就只有一条，且沉淀上清中都有（当然，并没与测序）。然后分别取沉淀和上清去转化我的底物（此处设有对照），经分析底物能被水解且产物与预测相同。所以，我判断目的蛋白应该是表达了，当然，还需要进一步验证那个小十几KD的带是不是我的目的蛋白~它的量是那么大那么大~
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3楼2016-03-15 16:53:50
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
还是上个图吧，毕竟蛋白胶只是粗略看大小

发自小木虫Android客户端
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天空才是极限，我有信心飞的更高！
4楼2016-03-15 20:12:50
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MarchZR

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
紫漠清扬: 金币+5 2016-03-22 09:19:34
内容已删除
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5楼2016-03-16 09:52:58
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