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小李纸11银虫 (正式写手)
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[求助]
求助，现在需要自己构建重组质粒，怎样选择合适的限制性内切酶呢。。。已有3人参与
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| 我已经把含有目的基因的质粒从大肠杆菌里提出来了，现在需要把它从该质粒上切下来，然后连接到毕赤酵母的空质粒上，请问我该如何选择合适的酶进行切割呢？需要考虑的因素有哪些呢？还有。。。是用双酶切还是单酶切比较合适呢？谢谢啦。。。 |
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【答案】应助回帖
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在草稿纸上自己画画，其实是可以琢磨清楚的。像这样将目的基因从一个载体转换到另一个载体上，也称为亚克隆，常用的方法就是酶切和pcr，而有合适酶的话，酶切常常是首选。酶切做亚克隆，你需要掌握实验中两个主角的信息:已经连有目的基因的载体和待连接的酵母载体的序列和图谱，这样你才有可能知道两个载体上现在都有哪些酶切位点，也就是你可以选择哪些酶（你可以在草稿纸上分别列出）。首先你要知道，进行酶切连接，是需要两个片段具有相同的粘性末端，即片段和载体要经过相同的酶切处理。那么实验开始，你从现有载体切下来片段去和另一个载体连接，那么你用哪个酶来切呢？原则就是你切下目的片段所用的酶，在酵母载体上也要有这个酶，这样才可以确保，你从其他载体拿过来的东西在它这同样能接受。关于你说的载体加保护碱基酶切，应该是你误解的，载体酶切位点外侧已经有碱基，不需要人为加的，而通常是进行pcr时，会在引物酶切位点两端加保护碱基，这是因为pcr产物是线性的，两端就是酶切位点，而这样裸露的位点，酶切时效率很低，所以就人为的给多加了几个碱基，方便酶切，即所谓的保护碱基。另一个移码突变，这个对于克隆载体来说，多克隆位点就是专门提供给你来插入片段的，而启动子就在多克隆位点上游，如果你的目的基因起始密码子和终止密码子都有，而你目的片段和启动子直接没有起始密码子，就不用担心会移码突变，因为转录翻译只有从你的起始密码子开始，没有其他选择（有些融合表达载体或者加标签载体除外）。 发自小木虫Android客户端 |
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蓉蓉aa
6楼2016-03-15 21:03:45
2楼2016-03-15 11:28:45
原海亮
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【答案】应助回帖
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小李纸11: 金币+8, ★★★★★最佳答案 2016-03-17 14:13:07
小李纸11: 金币+8, ★★★★★最佳答案 2016-03-17 14:13:07
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没有合适的酶切位点，就需要通过pcr方法将目的基因从载体上扩增下来，这时候就只用考虑酵母载体的酶切位点就行，选择好之后，就在设计引物时把选好的酶切位点加到引物的5’端，然后加保护碱基就OK 发自小木虫Android客户端 |
9楼2016-03-16 18:24:21
小李纸11
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8楼2016-03-16 18:18:17
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