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kingjazz23

金虫 (小有名气)

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[求助] CRISPR/Cas系列问题已有1人参与

您们好，今年研一下学期老板打算做CRISPR/Cas，叫我查查问题，我们打算做酵母的CRISPR/Cas，看了几篇文献，有些问题不是很懂，所以想问问你们：
（1）在paper中经常会看到一个a premature stop codon，想问问他有什么作用，一般看到都是用研究人员在PAM的位置引入的，不太清楚他们的意图是什么？
（2）经常在paper中看到gRNA cassette和plasmid，我知道plasmid是质粒的意思，而前面那个cassette不太清楚是什么意思，在DiCarlo的一篇文献中，他提到了两种gRNA的表达方法，一个是gRNA PCR cassette还有一个是gRNA plasmid，这两个到底有什么区别？
（3）经常在文章中出现的target sequence是存在于gRNA上的那段识别目标DNA的序列还是指含有PAM序列那段序列？
（4）文章中有时候会出现的tRNA是指tracrRNA吗？
（5）同样是在DiCarlo那篇文献中，其中有一句话是Donor DNA was designed to recombine within the gRNA CAN1.Y genomic target using homology arms to the site，
想问问这句话是什么意思？Donor DNA不是应该与基因组序列配对吗？通过同源臂进行修复，达到替换的效果，这里为什么说是与gRNA结合呢?
（6）文献中常常出现的oligonucleotide是指Donor DNA吗?

以上这些就是本人一些不太理解的地方，希望各路大神帮忙解决一下，谢谢！

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1楼2016-03-11 17:17:53

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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)

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专业: 病原微生物变异与耐药

【答案】应助回帖

pam与临近基序之间插入突变序列，一般是加一个终止密码子并使pam突变以及一个酶切位点，两个作用：使pam突变不再被cas识别；终止密码子是插入靶基因使靶基因提前表达终止；酶切位点是用于筛选的。突变是复制在修复模板上的，发生重组时，利用修复模板在基因组切口处引入突变；不用修复模板也是可以的，利用的是同源染色体作为修复模板，或者随机插入，但这种方式达到目的突变概率比较低。

发自小木虫Android客户端