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melers

[交流] 我做半定量表达时,内参和目标同时PCR,内参的亮度总是比目标条带亮很多

我做半定量表达时,内参和目标同时PCR,内参的亮度总是比目标条带亮很多,调整引物的产量,仍然不能解决,并且我只用25个循环,在平台期之前。希望大家给予帮助,谢谢了!!!
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bbcaaa888

铁虫 (小有名气)

可以减少模板用量,或者稀释模板;目标模板的量不变
2楼2008-10-15 12:35:12
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long76

新虫 (初入文坛)

循环数不能变
3楼2008-10-15 15:55:54
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melers

我是在同一个管子里一起P。一个管子同时加两对引物。后来降低了模板的量也不能成功,别人说两对引物有竞争,问了别人,人说用两个管子,所有的都相同,就是引物不同。最后把样品点到一起跑胶。

我觉得要是在一个体系里会更好
4楼2008-10-15 23:41:03
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米见方ggsddu

金虫 (小有名气)

only屋里哇啦

两者确实有竞争,可以在一起做。如果目的条带够短,25循环可以。至于亮度问题,把内参的浓度降低,与目的产物的引物比为1/2左右,应该会好些。
低调潜行
5楼2008-10-20 21:38:16
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chge

金虫 (小有名气)

最好的解决的方法是:换内参!

可用于定量和半定量的内参有很多,有一些内参的含量较高,如b-actin等,
有一些则较低,如HPRT等。可以试一试一些在细胞中表达量低的内参。
详细的资料可以参考Qiagen的定量PCR的说明书。
6楼2008-10-20 22:24:43
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