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melers

[交流] 我做半定量表达时，内参和目标同时PCR，内参的亮度总是比目标条带亮很多

我做半定量表达时，内参和目标同时PCR，内参的亮度总是比目标条带亮很多，调整引物的产量，仍然不能解决，并且我只用25个循环，在平台期之前。希望大家给予帮助，谢谢了！！！
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1楼 2008-10-15 12:00:05
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bbcaaa888

铁虫 (小有名气)
可以减少模板用量，或者稀释模板；目标模板的量不变
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2楼2008-10-15 12:35:12
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long76

新虫 (初入文坛)
循环数不能变
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3楼2008-10-15 15:55:54
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melers

我是在同一个管子里一起P。一个管子同时加两对引物。后来降低了模板的量也不能成功，别人说两对引物有竞争，问了别人，人说用两个管子，所有的都相同，就是引物不同。最后把样品点到一起跑胶。

我觉得要是在一个体系里会更好
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4楼2008-10-15 23:41:03
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米见方ggsddu

金虫 (小有名气)

only屋里哇啦
两者确实有竞争，可以在一起做。如果目的条带够短，25循环可以。至于亮度问题，把内参的浓度降低，与目的产物的引物比为1/2左右，应该会好些。
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低调潜行
5楼2008-10-20 21:38:16
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chge

金虫 (小有名气)
最好的解决的方法是：换内参！

可用于定量和半定量的内参有很多，有一些内参的含量较高，如b-actin等，
有一些则较低，如HPRT等。可以试一试一些在细胞中表达量低的内参。
详细的资料可以参考Qiagen的定量PCR的说明书。
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6楼2008-10-20 22:24:43
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