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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请教利用PCR产物做模板跑pcr，条带变化的问题
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一张七块的

新虫 (初入文坛)

[求助] 请教利用PCR产物做模板跑pcr，条带变化的问题 已有1人参与

新手一枚，用cDNA做了PCR,35个循环，有目标条带，杂带不多
然后把PCR产物稀释了100倍做模板，其他体系，退火温度等都一样，跑出来的目标条带反而更暗了，还出了一条比目标条带还亮的杂带
目标条带800度BP，杂带400多BP
两次均是35个循环
求问这是怎么回事。。。
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1楼 2016-03-09 10:33:08
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一张七块的

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-09 11:57:26
稀释1000倍以上吧。100倍浓度有点高。

昨晚做了梯度，稀释了10,100,1000,10000倍做模板，全都是200bp左右的杂带，而且浓度越低的越亮，没有目标条带。。。。
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3楼2016-03-10 08:46:33
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ken19860823

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一张七块的: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2016-03-11 17:35:30
稀释1000倍以上吧。100倍浓度有点高。
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做基因修饰的老菜鸡
2楼2016-03-09 11:57:26
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ken19860823

木虫 (正式写手)
既然第一次pcr有结果，可以直接连t载体了测序看看

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做基因修饰的老菜鸡
4楼2016-03-10 08:56:46
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MaxInTheWind

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 一张七块的 at 2016-03-10 08:46:33
昨晚做了梯度，稀释了10,100,1000,10000倍做模板，全都是200bp左右的杂带，而且浓度越低的越亮，没有目标条带。。。。...

以前能做出来现在不行了，猜一下是不是polymerase失效了？再用cDNA试一次看看
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5楼2016-03-10 10:51:50
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