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wqw1212

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助，！！！

本人目前正在克隆2个基因  以下为我设计的引物参数    长度大概均为1000bp左右。。   我自己用TAKARA的GXL酶  和生工的聚合酶  均不能成功克隆！   求大神指导！小弟感激不尽

求助，！！！


求助，！！！-1


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1楼 2016-03-08 21:05:32
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wqw1212

新虫 (初入文坛)
别沉啊   求指导

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2楼2016-03-08 23:12:12
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ok_hu

至尊木虫 (著名写手)
做不出实验的时候建议加对照。1. 找能扩增出片段的引物和模板，pcr，验证酶和pcr仪是否正常。排除酶和设备问题后，用正常的酶，自己的模板，其他能扩增的引物，如内参基因，验证模板是否正常。一切正常之后，可以跑梯度pcr，也可以跑touchdown。如果实在扩不出来，就要分析模板和引物了。因为模板有高级结构，如gc含量高，是比较难扩的；其次，如果模板是cdna，有可能表达量低，那就要找高表达的时期，或者诱导其高表达。还有引物是否正确

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3楼2016-03-08 23:32:08
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wqw1212

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ok_hu at 2016-03-08 23:32:08
做不出实验的时候建议加对照。1. 找能扩增出片段的引物和模板，pcr，验证酶和pcr仪是否正常。排除酶和设备问题后，用正常的酶，自己的模板，其他能扩增的引物，如内参基因，验证模板是否正常。一切正常之后，可以跑 ...

谢谢你   我用相同的模板  可以成功扩增出其他前段    但是这两个不合适   请问下我设计的引物参数值 还合适吧？

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4楼2016-03-09 11:09:27
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ok_hu

至尊木虫 (著名写手)
引物的参数意义不大的，有时候得分高也扩不出来。先跑个touchdown和梯度再说吧

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5楼2016-03-09 12:04:35
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卡维斯

金虫 (正式写手)
可以用下GC buffer 一类的或者换用高GC的酶，另外虫友ok_hu说的对，你得设置对照检验问题所在。如果可以建议重新设计引物。
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6楼2016-03-09 12:11:22
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wqw1212

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ok_hu at 2016-03-09 12:04:35
引物的参数意义不大的，有时候得分高也扩不出来。先跑个touchdown和梯度再说吧

嗯  谢谢哈   我尝试哈

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7楼2016-03-10 16:50:28
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wqw1212

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-09 12:11:22
可以用下GC buffer 一类的或者换用高GC的酶，另外虫友ok_hu说的对，你得设置对照检验问题所在。如果可以建议重新设计引物。

嗯嗯   谢谢指导    哎  实验做不出来    闹心啊！

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8楼2016-03-10 16:51:05
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