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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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ken19860823

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by amberhwk at 2016-03-09 16:25:33
试剂盒提取质粒然后就直接双酶切，切出来有三条带，两条不太明显，是pcoldTF 载体
...

首先，你要酶切一个质粒，你要搞清楚质粒的全序列，这样才方便你查看你的限制性酶切位点在哪，有多少个。一般质粒用于克隆片段，克隆进去的片段一般插入的位点是多克隆位点（就是许多个相邻的限制性酶切位点）。比如你要克隆片段A到你的目的载体PcodTF载体，首先搞清楚你的片段含不含有载体多克隆位点的限制性酶切位点。选取两个不含有的限制性酶切位点作为A片段左右两端引物的一部分。这样用选择的两个酶切位点分别酶切PcoldTF和PCR扩增出来的A片段，胶回收两个片段做连接就可以转化挑克隆了。
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做基因修饰的老菜鸡
11楼2016-03-09 17:26:42
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ken19860823

木虫 (正式写手)
我查了下你的PcoldTF载体，载体的多克隆位点我放在了附件里，多克隆位点的酶切位点是为克隆准备的所以载体其他片段不含有这些酶切位点。常见的位点有，xhoI,kpnI,NdeI,BamHi,HindIII,salI,xbaI,另外两个更常见怕片段里面含有所以一般选不到。如果你的克隆的片段A不含有EcoRI和HindIII，你就可以设计引物分别包含这两个位点，做PCR，一般我们是先克隆到T载体，如果你是用高保真酶做的PCR，P完之后用TAQ酶处理15min在72度，目的是非保证酶一般在扩增片段末端加一个A，这样可以直接连进T载体，连到载体后方便做测序挑选正确的克隆。选到正确克隆后做酶切，切出来的对应大小的A片段后纯化连到同样用EcoRI和HindIII酶切的PcoldTF载体里就行了。
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  • 附件 1 : 酶切位点.png
    • 2016-03-09 17:30:52, 14.14 K
做基因修饰的老菜鸡
12楼2016-03-09 17:39:01
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ken19860823

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by amberhwk at 2016-03-09 17:26:26
请问这个是怎么回事，正常吗
...

你要看你用哪两个酶酶切的啊。如果你用的酶切位点其中一个有两个位点，那么这个就是三条带啊。还有就是酶切不完全条带就多了，所以一定要跑质粒对照。
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做基因修饰的老菜鸡
13楼2016-03-09 17:41:56
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amberhwk

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-09 17:41:56
你要看你用哪两个酶酶切的啊。如果你用的酶切位点其中一个有两个位点，那么这个就是三条带啊。还有就是酶切不完全条带就多了，所以一定要跑质粒对照。...

谢谢解答，我是用EcoR 1和Xba 1两个酶，真的太感谢，刚接触，很多还不明白

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14楼2016-03-09 18:09:54
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ken19860823

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by amberhwk at 2016-03-09 18:09:54
谢谢解答，我是用EcoR 1和Xba 1两个酶，真的太感谢，刚接触，很多还不明白
...

你如果用EcoRI和XbaI,跑胶肯定是对应载体大小的一条带5769bp，在质粒的下面两条带之间。分子生物原理太简单，做起来是会碰到一些问题，多交流就行，
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做基因修饰的老菜鸡
15楼2016-03-09 19:37:43
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