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vanessa_324

铁虫 (初入文坛)

[交流] 求助!如何把两个4K的片段连起来啊? 已有6人参与

我现在在构建一种病毒的重组质粒,由于长度太长,需要分段扩增再拼接起来。
现在已获得两个4K的片段,想咨询一下,有没有同门之前拼接过这么长的片段啊?是用什么方法呢?
两个片段:第一个片段,5‘端有一个KPNI位点,3’端有SalI 位点;第二个片段,5‘有SalI位点,3’有NhelI位点
想过直接用酶连接,可是应该效率很低
想过用overlap pcr,但是长度好像受限制
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Holly_yang

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 苏蛋9966 at 2016-03-09 15:10:29
扩8k还好吧,我扩增过10.8k的,用的gxl酶  也扩增过6k片段很容易啊  注意模板浓度

模板浓度应该多大比较合适呢?是摩尔浓度吗?
6楼2016-03-12 15:59:04
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风吹我已散

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
分别连到质粒上去,再试着切一个片段下来,连到另外一个载体上去。

发自小木虫Android客户端
2楼2016-03-08 16:13:22
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lifechuteng

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
Overlap PCR绝对没有问题,只要中间重叠序列设计合理。
再就是酶很重要,一定要选择高保真、高扩增效率的酶。比如PrimerStar Max,phusion等等。
3楼2016-03-08 16:28:57
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苏蛋9966

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
扩8k还好吧,我扩增过10.8k的,用的gxl酶  也扩增过6k片段很容易啊  注意模板浓度
4楼2016-03-09 15:10:29
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