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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助！如何把两个4K的片段连起来啊？
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vanessa_324

铁虫 (初入文坛)

[交流] 求助！如何把两个4K的片段连起来啊？ 已有6人参与

我现在在构建一种病毒的重组质粒，由于长度太长，需要分段扩增再拼接起来。
现在已获得两个4K的片段，想咨询一下，有没有同门之前拼接过这么长的片段啊？是用什么方法呢？
两个片段：第一个片段，5‘端有一个KPNI位点，3’端有SalI 位点；第二个片段，5‘有SalI位点，3’有NhelI位点
想过直接用酶连接，可是应该效率很低
想过用overlap pcr，但是长度好像受限制
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1楼 2016-03-08 16:09:15
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风吹我已散

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
分别连到质粒上去，再试着切一个片段下来，连到另外一个载体上去。

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2楼2016-03-08 16:13:22
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lifechuteng

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
Overlap PCR绝对没有问题，只要中间重叠序列设计合理。
再就是酶很重要，一定要选择高保真、高扩增效率的酶。比如PrimerStar Max，phusion等等。
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3楼2016-03-08 16:28:57
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苏蛋9966

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
扩8k还好吧，我扩增过10.8k的，用的gxl酶  也扩增过6k片段很容易啊  注意模板浓度
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4楼2016-03-09 15:10:29
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易水寒明

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
\现在市场上有卖这种长片段的专用的连接酶的！你去NEB搜一下
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5楼2016-03-10 08:52:14
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Holly_yang

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 苏蛋9966 at 2016-03-09 15:10:29
扩8k还好吧，我扩增过10.8k的，用的gxl酶  也扩增过6k片段很容易啊  注意模板浓度

模板浓度应该多大比较合适呢？是摩尔浓度吗？
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6楼2016-03-12 15:59:04
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zss莫问

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 苏蛋9966 at 2016-03-09 15:10:29
扩8k还好吧，我扩增过10.8k的，用的gxl酶  也扩增过6k片段很容易啊  注意模板浓度

可以把你的实验步骤分享一下吗？最近在拼接基因，老是拼不上啊，

发自小木虫IOS客户端
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7楼2018-09-20 15:16:17
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