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zhuweilin

银虫 (初入文坛)

[求助] 菜鸟求助 已有1人参与

最近实验室刚做WB，昆虫High five细胞导入重组PIZT/V5-HIS-目的片段  质粒48h后裂解做WB,  5%伊利脱脂奶粉TBST稀释封闭液封闭，1:1000~2000一抗兔抗  封闭液稀释  过夜4度 ， TBST 洗三次。G&R HRP二抗 封闭液稀释，孵育1h。TBST洗3三次  ，ECL发光试剂盒处理曝光，图片如下，请问为何出现那么多非特异性条带，而特异性条带却没有？问题出在哪？求助？

菜鸟求助
IMG_20160108_120536.jpg
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居安思危
1楼 2016-03-07 14:59:53
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kop9831

金虫 (小有名气)
封闭的时候封闭液就不要加吐温了，你封闭时间多少？孵抗体时最好在自封袋里密闭缓慢混悬孵育，没出现特异带你看看是不是一抗浓度太低了，二抗浓度却太高了？
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比较擅长做图，尤其是SCI投稿用的，常用工具：PS、AI、Image-Pro、GraphpadPrism
2楼2016-03-07 16:35:31
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zhuweilin

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kop9831 at 2016-03-07 16:35:31
封闭的时候封闭液就不要加吐温了，你封闭时间多少？孵抗体时最好在自封袋里密闭缓慢混悬孵育，没出现特异带你看看是不是一抗浓度太低了，二抗浓度却太高了？

封闭一个小时，抗体是在自封袋，网上买的相片过胶膜那种剪裁用封口机封口   会对抗体有影响不，一抗试过1:1000甚至大于1：1000
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居安思危
3楼2016-03-07 16:55:43
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kop9831

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhuweilin at 2016-03-07 16:55:43
封闭一个小时，抗体是在自封袋，网上买的相片过胶膜那种剪裁用封口机封口   会对抗体有影响不，一抗试过1:1000甚至大于1：1000...

你曝光时加发光液会看到很强的荧光吗？如果有设备，试试用曝光的机器曝光
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比较擅长做图，尤其是SCI投稿用的，常用工具：PS、AI、Image-Pro、GraphpadPrism
4楼2016-03-07 17:09:18
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zhuweilin

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kop9831 at 2016-03-07 17:09:18
你曝光时加发光液会看到很强的荧光吗？如果有设备，试试用曝光的机器曝光...

可以看到很强荧光，压一下就如图片一样，我们这没有曝光机
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居安思危
5楼2016-03-07 17:13:46
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314300420

捐助贵宾 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
下面那个粗的条带不是特异性条带吗？把一抗浓度降低就行了
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6楼2016-03-07 21:45:03
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zhuweilin

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 314300420 at 2016-03-07 21:45:03
下面那个粗的条带不是特异性条带吗？把一抗浓度降低就行了

不是特异性条带，我每道的蛋白大小都不一样，第一道是GFP的，最底下那条亮带分子量在15-20KDA这样
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居安思危
7楼2016-03-08 08:24:47
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314300420

捐助贵宾 (著名写手)
那就涉及到一抗是否识别抗原，抗原是否有表达的问题了，可以换一个标签抗体检测下，如果还是没有目的条带，应该就是抗原没有表达的问题了

发自小木虫IOS客户端
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8楼2016-03-08 20:51:17
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