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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 【新手】DNS法测α淀粉酶 抑制实验 反应进程曲线遇到问题
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RX_豆丁

铁虫 (正式写手)

[求助] 【新手】DNS法测α淀粉酶 抑制实验 反应进程曲线遇到问题 已有3人参与

本人是个酶方面的新手，想做某种物质对淀粉酶的抑制作用，这是第一次，采用的是DNS法测定产物糖的方法。
我是自己提取天然产物，然后买淀粉酶，测定天然产物对淀粉酶的抑制作用。

① 我想先做反应进程曲线，确定合适的酶活和反应时间。
      a.  预实验，1%的淀粉浓度，我选取了0.1浓度的酶，结果1-6min的OD值都是在0的上下浮动，我怀疑是淀粉酶失活了，或者浓度太低了（酶溶液一开始不懂，放在了冷藏一晚上，估计失活了）
     b.于是，我配置了1浓度的酶，然后配置完成立刻去测定，从1-10min的OD值都是0.5左右波动
     c. 我蒙圈了，嗯，可能是酶浓度太大了，所以反应很快，1min之内就把所有淀粉都反应成了糖。于是，我配置了0.6和0.3的浓度的酶，测定1-6min的OD值变化，然后0.3的不知道为什么是乱七八糟的，0.6的结果还行，1min的时候是0.2左右，但是从2min开始之后就全部都是0.5左右。
     d.让我很奔溃，合适的酶浓度和反应时间，到底怎么才能准确的测定出来，我的问题到底出在那里？？？
       如果说我的酶反应饱和了。为什么OD的最大值才0.5左右，我看有几个文献都达到了1左右。

② 看文献，有的测定一种物质对淀粉酶得抑制，做了阴性、阳性和空白对照，可是有的实验就没有阳性对照，一定要做吗？
③ 看文献，有一篇文献的抑制剂是有有机溶剂溶解的，就是水和乙醇一定比例，那我在想，乙醇不会对酶的活性产生影响吗？这篇文章科学么，居然做出来，结果很好，而且还发表了！

求大神帮忙，我是试了好多还不出满意结果，感觉奔溃了！谢谢
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考上研究生的都是神
1楼 2016-03-05 15:03:13
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RX_豆丁

铁虫 (正式写手)
想做个好结果为什么这么难，半路出家好难
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考上研究生的都是神
2楼2016-03-05 15:04:26
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RX_豆丁

铁虫 (正式写手)
对了，还想问下，DNS法测定还原糖，如果说我加热完后，放置了不同的时间去测定，这个时间是不是对吸光度也有影响？        因为给的步骤是室温冷却20min，而我一个人一下子不能那么多同时反应，所以冷却放置的时间不同。理论上我觉得是没有影响的，但是不知道了……
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考上研究生的都是神
3楼2016-03-05 15:07:29
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周珍珍

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
非常有影响，一秒都不能差！

发自小木虫Android客户端
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4楼2016-03-07 08:07:23
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RX_豆丁

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 周珍珍 at 2016-03-07 08:07:23
非常有影响，一秒都不能差！

亲有什么建议吗？一个人做重复不可能一下子保证那么多，难道要1分钟的做完了放20min冷却定容去测，然后再做2min的，然后再做3分的么，这样效率好低。           这么看，这个实验人为的误差是很大的，因为1秒钟就差很多
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考上研究生的都是神
5楼2016-03-07 10:12:38
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RX_豆丁

铁虫 (正式写手)
为什么只有一个人搭理我，求帮助呀！！！！！
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考上研究生的都是神
6楼2016-03-07 10:13:56
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蛋蛋1533

银虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by RX_豆丁 at 2016-03-07 10:13:56
为什么只有一个人搭理我，求帮助呀！！！！！

我也不知道，我想问下你酶浓度怎么配置呢？买来的酶知道的是质量，那酶的分子式也不知道啊，怎么配置浓度溶液呢
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7楼2016-03-09 13:44:12
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RX_豆丁

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 蛋蛋1533 at 2016-03-09 13:44:12
我也不知道，我想问下你酶浓度怎么配置呢？买来的酶知道的是质量，那酶的分子式也不知道啊，怎么配置浓度溶液呢...

我直接称重溶解的，mg/ml这种，保证1ml酶活不少于3U
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考上研究生的都是神
8楼2016-03-10 11:10:37
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RX_豆丁

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 蛋蛋1533 at 2016-03-09 13:44:12
我也不知道，我想问下你酶浓度怎么配置呢？买来的酶知道的是质量，那酶的分子式也不知道啊，怎么配置浓度溶液呢...

亲你知道分子式要干嘛呀？反正我不研究这个酶，我只是用用。但是感觉每次浓度都不合理，出不来反应进程曲线
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考上研究生的都是神
9楼2016-03-10 11:11:23
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蛋蛋1533

银虫 (职业作家)
引用回帖:
9楼: Originally posted by RX_豆丁 at 2016-03-10 11:11:23
亲你知道分子式要干嘛呀？反正我不研究这个酶，我只是用用。但是感觉每次浓度都不合理，出不来反应进程曲线...

我也不知道，也没人回复，单位换算搞不懂，浓度挺重要的，
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10楼2016-03-10 20:28:32
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