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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR 条带不亮
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qiu_ni

银虫 (小有名气)

[交流] PCR 条带不亮

PCR扩增几条氮循环相关的基因，引物是由已知序列设计的，但是扩增结果不理想，大多数条带都不是很亮，与所跑Marker 相差甚远。试图增加过扩增循环数，但是效果不理想，也增加过退火温度，但有的基因就直接扩增不出来。求问各位大神这是怎么回事？能否给点参考意见。不甚感激。
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nozuonodie
1楼 2016-03-04 15:04:46
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Esther_zhang

新虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
qiu_ni: 金币+1, 可以试试 2016-03-04 15:30:31
可以从增加引物浓度或者模板量，降低退火温度等方面试试啊。你增大退火温度，估计只会越P越弱。
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2楼2016-03-04 15:21:03
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ken19860823

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
qiu_ni: 金币+1 2016-03-04 17:00:07
用slow-down的程序吧，百试不爽。
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做基因修饰的老菜鸡
3楼2016-03-04 15:41:08
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qiu_ni

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-04 15:41:08
用slow-down的程序吧，百试不爽。

什么叫做slow-down，求解释
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nozuonodie
4楼2016-03-04 17:00:03
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yvonne9044

新虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
qiu_ni: 金币+1 2016-03-05 13:33:11
他说的是降落pcr？最佳的退火温度需要摸索 我的方法是用梯度pcr仪不用温度都p一遍，还有一个方法就是二次pcr，基本就很亮了

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5楼2016-03-04 18:31:53
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sandycool

铁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
也可能是引物的问题

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6楼2016-03-04 20:29:22
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张凡云

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
qiu_ni: 金币+1 2016-03-05 13:32:55
建议你用第一次的PCR产物为模板，再进行一次pcr，我今天就是这样的，克隆一个植物里面的酶基因，你试试吧。pcr的条件可以不用改

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7楼2016-03-04 20:44:07
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卡维斯

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
模板浓度是不是合适？参考所用酶的扩增条件中模板浓度要求。
引物质量高不高？二聚体？互补性？DNAMAN可以大体检测下。
PCR条件是否优化过？退火温度？闲摸索退火温度麻烦，可以试试Touch-down程序。
提基因组所用取材是否合理？该基因表达与否？
上面所说的二次PCR也可以但是注意设置对照，防止串管污染。
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8楼2016-03-07 20:07:20
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