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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请问下PCR过程中设置两个复性温度是什么意思
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z631535213

木虫 (正式写手)

[求助] 请问下PCR过程中设置两个复性温度是什么意思 已有2人参与

楼在一篇产品资料里看到其在进行PCR过程中，复性温度设置了两个：
比如
        98℃ 10min，
        95℃ 10sec，50℃ 90sec, 72℃ 30sec       —— 10 cycles
        95℃ 10sec，55℃ 90sec, 72℃ 30sec       —— 30 cycles
        72℃  5min
        4℃ Hold


我猜想设置了两个复性温度50℃,55℃，较低的50℃是为了放大初始模版量（哪怕可能产生非特异性扩增），较高的55℃是避免非特异性扩增时所采取的正常PCR温度

想请假下各位，是这样的吗？
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1楼 2016-03-01 16:47:08
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kaobo2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
z631535213: 金币+5, ★有帮助 2016-03-02 07:50:33
我的观点与楼主一样，有点类似TD-PCR。
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2楼2016-03-01 21:14:49
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z631535213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kaobo2012 at 2016-03-01 21:14:49
我的观点与楼主一样，有点类似TD-PCR。

多谢。俺去了解下TD PCR

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3楼2016-03-02 07:49:19
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williamwjj

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
touchdown pcr更理想一些

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4楼2016-03-02 08:13:50
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z631535213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by williamwjj at 2016-03-02 08:13:50
touchdown pcr更理想一些

嗯，感觉最近做的PCR可以去试一试TD PCR。

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5楼2016-03-02 08:23:24
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柚子小姐lu

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kaobo2012 at 2016-03-01 21:14:49
我的观点与楼主一样，有点类似TD-PCR。

请问TD-PCR两次的退火温度应该怎么选择呢？ 最近做的荧光定量PCR实验引物出现了严重的非特异性杂交，退火温度设定的37℃，引物的理论Tm值大约在54℃。请问这种方法有用吗，是因为设定的退火温度太低了吗才出现非特异性杂交？求指教
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6楼2016-03-18 23:26:05
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z631535213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 柚子小姐lu at 2016-03-18 23:26:05
请问TD-PCR两次的退火温度应该怎么选择呢？ 最近做的荧光定量PCR实验引物出现了严重的非特异性杂交，退火温度设定的37℃，引物的理论Tm值大约在54℃。请问这种方法有用吗，是因为设定的退火温度太低了吗才出现非特 ...

退火温度设高了，特异性好但扩增效率不好；温度设低了，扩增效率好但特异性不好。这是俺对退火温度的理解

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7楼2016-03-19 06:43:50
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z631535213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 柚子小姐lu at 2016-03-18 23:26:05
请问TD-PCR两次的退火温度应该怎么选择呢？ 最近做的荧光定量PCR实验引物出现了严重的非特异性杂交，退火温度设定的37℃，引物的理论Tm值大约在54℃。请问这种方法有用吗，是因为设定的退火温度太低了吗才出现非特 ...

一般退火温度是在引物tm值正负5度吧，不会低到37度的。资料上说，相差一度，扩增效率有4倍的差异，所以可以从理论tm值便扩增边降低退火温度

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8楼2016-03-19 06:47:39
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