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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2025级博士研究生招生报考通知
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z631535213

木虫 (正式写手)

[求助] 请问下PCR过程中设置两个复性温度是什么意思已有2人参与

楼在一篇产品资料里看到其在进行PCR过程中,复性温度设置了两个:
比如
        98℃ 10min,
        95℃ 10sec,50℃ 90sec, 72℃ 30sec       —— 10 cycles
        95℃ 10sec,55℃ 90sec, 72℃ 30sec       —— 30 cycles
        72℃  5min
        4℃ Hold


我猜想设置了两个复性温度50℃,55℃,较低的50℃是为了放大初始模版量(哪怕可能产生非特异性扩增),较高的55℃是避免非特异性扩增时所采取的正常PCR温度

想请假下各位,是这样的吗?
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kaobo2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
z631535213: 金币+5, 有帮助 2016-03-02 07:50:33
我的观点与楼主一样,有点类似TD-PCR。
2楼2016-03-01 21:14:49
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z631535213

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kaobo2012 at 2016-03-01 21:14:49
我的观点与楼主一样,有点类似TD-PCR。

多谢。俺去了解下TD PCR

发自小木虫IOS客户端
3楼2016-03-02 07:49:19
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williamwjj

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
touchdown pcr更理想一些

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4楼2016-03-02 08:13:50
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z631535213

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by williamwjj at 2016-03-02 08:13:50
touchdown pcr更理想一些

嗯,感觉最近做的PCR可以去试一试TD PCR。

发自小木虫IOS客户端
5楼2016-03-02 08:23:24
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柚子小姐lu

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kaobo2012 at 2016-03-01 21:14:49
我的观点与楼主一样,有点类似TD-PCR。

请问TD-PCR两次的退火温度应该怎么选择呢? 最近做的荧光定量PCR实验引物出现了严重的非特异性杂交,退火温度设定的37℃,引物的理论Tm值大约在54℃。请问这种方法有用吗,是因为设定的退火温度太低了吗才出现非特异性杂交?求指教
6楼2016-03-18 23:26:05
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z631535213

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 柚子小姐lu at 2016-03-18 23:26:05
请问TD-PCR两次的退火温度应该怎么选择呢? 最近做的荧光定量PCR实验引物出现了严重的非特异性杂交,退火温度设定的37℃,引物的理论Tm值大约在54℃。请问这种方法有用吗,是因为设定的退火温度太低了吗才出现非特 ...

退火温度设高了,特异性好但扩增效率不好;温度设低了,扩增效率好但特异性不好。这是俺对退火温度的理解

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7楼2016-03-19 06:43:50
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z631535213

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 柚子小姐lu at 2016-03-18 23:26:05
请问TD-PCR两次的退火温度应该怎么选择呢? 最近做的荧光定量PCR实验引物出现了严重的非特异性杂交,退火温度设定的37℃,引物的理论Tm值大约在54℃。请问这种方法有用吗,是因为设定的退火温度太低了吗才出现非特 ...

一般退火温度是在引物tm值正负5度吧,不会低到37度的。资料上说,相差一度,扩增效率有4倍的差异,所以可以从理论tm值便扩增边降低退火温度

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8楼2016-03-19 06:47:39
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