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在线等,关于3‘RACE,求助高手!
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最近在做RACE,是很简单的3'RACE,但是做了半个月了,都没有P出条带来。 很着急! 我是用自己设计的5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'做反转录,然后用5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' 与自己的特异性上游引物(1)做PCR,没有条带出现。但是我还是用这个 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'引物反转录的第一链做模板,用特异性上游引物(1)与一个特异性的下游引物(2)做中间一个片段的PCR时,却是可以P出目的条带的,不知道问题出在哪里。延伸时间已经很长了,退火温度也调到最低。两个相同的反应体系,只是下游的引物不一样而已,为什么RACE就做不出呢?求达人指点一下! 而且我用自己设计的接头接头引物反转录出来的模板,P一些特定的片段时经常是没有结果的,而用试剂盒自带的oligDT引物反转录之后,就可以P出这些特定的条带,这是不是说明我的Race引物有问题呢?应该怎么改?或者注意什么? 还有,大家在做完反转录后PCR时,是用反转录的原液来做模板,还是稀释了多少倍后再用来做模板啊? 好像还看到有的说明书上说要将一次反转录的原液(20ul)一次性的做某一片段的PCR,而且还不用再加DNTP(因为反转录时已经加了),有人这样做过吗? |
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4楼2008-10-13 09:06:14
superarm
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2楼2008-10-12 11:21:46
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