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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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xuheping

[交流] 在线等，关于3‘RACE，求助高手！

最近在做RACE，是很简单的3'RACE,但是做了半个月了，都没有P出条带来。 很着急！
   
    我是用自己设计的5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'做反转录，然后用5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' 与自己的特异性上游引物（1）做PCR，没有条带出现。但是我还是用这个
5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'引物反转录的第一链做模板，用特异性上游引物（1）与一个特异性的下游引物（2）做中间一个片段的PCR时，却是可以P出目的条带的，不知道问题出在哪里。延伸时间已经很长了，退火温度也调到最低。两个相同的反应体系，只是下游的引物不一样而已，为什么RACE就做不出呢？求达人指点一下！
   
   而且我用自己设计的接头接头引物反转录出来的模板，P一些特定的片段时经常是没有结果的，而用试剂盒自带的oligDT引物反转录之后，就可以P出这些特定的条带，这是不是说明我的Race引物有问题呢？应该怎么改？或者注意什么?

  还有，大家在做完反转录后PCR时，是用反转录的原液来做模板，还是稀释了多少倍后再用来做模板啊？
好像还看到有的说明书上说要将一次反转录的原液（20ul）一次性的做某一片段的PCR，而且还不用再加DNTP（因为反转录时已经加了），有人这样做过吗？
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1楼 2008-10-11 21:57:30
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superarm

金虫 (正式写手)
再设计一个特异性引物，做个巢式PCR.
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2楼2008-10-12 11:21:46
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taishuai2004

我也没有仔细琢磨
你在考虑一下  
是不是应该是GGCCACGCGTCGACTAGTAC的反向互补序列
而且反转录的引物在合时 你应该告诉公司做RNAase处理
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3楼2008-10-12 16:57:27
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xuheping

做巢式的话是针对RACE的特异性不好来说的吧？即有多条条带时，为了提高特异性才来做的，而我这个是没有条带！

我觉得楼上的一点倒是提醒了我，也许这个引物需要提醒公司做RNA酶消化处理。那个接头引物不用反的。
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4楼2008-10-13 09:06:14
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xuheping

刚问了，居然说国内的引物没有RNA FREE这种处理的技术！还是不知道原因在哪里
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5楼2008-10-13 09:31:03
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superarm

金虫 (正式写手)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 7-26 17:04
引物好像没有必要RNA FREE处理，我都用生工的引物，基因丰度低的有必要二次扩增。最好巢式，我的经验之谈 。
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6楼2008-10-14 17:01:37
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