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swknptb429新虫 (初入文坛)
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提取质粒和基因组的区别 已有2人参与
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在分子生物实验室中，我们常用各种试剂盒（e.g. QIAGEN mini/midi/maxi prep）做质粒DNA提取（质粒提取相关文章），如果都遵循操作，所得样本基本上是质粒DNA（plasmid），只有少量的基因组DNA（genomic DNA）会混入进来。那么问题来了，基因组DNA和质粒DNA同为DNA分子，为什么基因组DNA没有被纯化出来呢？难道硅胶柱都自己有意识不成，可以分辨哪个是小型环状DNA，哪个是大号基因组DNA……说到这里不得不提提取质粒DNA和基因组DNA的区别。 基因组DNA提取 相比于质粒DNA提取，基因组DNA的提取更简单些，步骤如下： 1裂解 只要打开细胞将基因组DNA释放出来就好了。一般来说，如果有细胞壁，就先破坏细胞壁，然后破坏细胞膜，细胞的DNA物质就全释放出来。关于打破细胞壁的方法，请参见历史文章（细胞裂解简述和五种细胞壁结构）。从经验上来看，机械裂解（如滚珠搅拌法和超声波破碎法）要比化学裂解（如酶溶裂解）要来得快而且全面。 2纯化 只要基因组DNA从细胞里释放出来，接下来要做的就是纯化它们。一般可以采用苯酚-氯仿抽提法（历史文章点这里）或者直接过硅胶柱。值得注意的是，基因组DNA由于很大，基本上在提纯以后不会保持完整，而是会碎裂成片段。但这对后续可能进行的PCR、qPCR不但没有坏处，反而是有好处的。不完整的DNA更容易变性，因此有益于PCR的进行。 质粒DNA提取 质粒DNA的提取比基因组DNA提取更复杂一些，因为要在提取的过程中避免基因组DNA的污染。和基因组DNA提取法最大的区别在于细胞裂解的方法。 1裂解 提取质粒DNA时，只采用强碱裂解法（alkaline lysis）。这个方法是由Birnboim和Doly在1979年发明的，在SCI上原著文章的引用量至今为止已达到12886，可以算是分子生物学里殿堂级的实验方法（科普ps：另外一个殿堂级方法，bradford assay，原文发于1976，至今引用量187783）。强碱裂解液里有氢氧化钠（NaOH）和十二烷基硫酸钠（SDS：Sodium dodecyl sulfate），目的是让质粒DNA和基因组DNA完全失活，使双链分子全部变成单链。使用强碱裂解的时候要注意不能裂解时间过长，否则对质粒DNA和基因组DNA产生不可逆形变就不好了（< 5 min）。 接下来强碱液被中和使裂解反应停止，这里就是分离质粒DNA和基因组DNA的关键。质粒DNA分子相对较小，互补链很容易重新组合成双链而回复活性，而基因组DNA较大，在形成双链的过程中很容易和其他蛋白缠绕在一起，导致无法形成完整的双链。和蛋白缠绕的基因组DNA就可以在提纯过程中被除去。 2提纯 可以用乙醇提取法或是硅胶柱提取（历史文章点这里）。这样提取出来的DNA基本上是质粒，而且可以用于克隆、测序等等后续的活动，如果质粒DNA要用于转染（transfection）或者离子交换（anion exchange），质粒还需要额外处理。 发自小木虫IOS客户端 [ Last edited by 豆哥 on 2016-2-27 at 11:07 ] |
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