应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 构建shRNA慢病毒，引物退火程序怎么设定？
81/1返回列表
查看: 13627  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

永远一片天

新虫 (正式写手)

[求助] 构建shRNA慢病毒，引物退火程序怎么设定？ 已有1人参与

构建shRNA慢病毒，引物退火程序怎么设定？求帮助，50bp左右的两个互补单链引物如何退火形成双链，求具体的程序。
自己在文献查到到的如下，不知道可不可以，有问题吗？
用ddH2O 稀释引物，使终浓度为100μM。分别吸取10μl 的上下游引物混合并吹打均匀放入PCR 管内进行退火，程序如下：
95℃ 30 s，72℃ 2 min，37℃ 2 min，25℃ 2 min。
请做过的同志们帮帮忙，具体的体系和程序该怎么设定，需要什么离子之类的吗？第一次接触，实验室无相关经验，急切求帮助。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

生物科学系列

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2016-05-07 21:28:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
永远一片天: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-05-09 21:54:04
我没做过shrna退火，但是做过cas9的gRNA退火，程序这么设置的：
赞一下 回复此楼
2楼2016-05-08 15:05:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-07-20 07:28:13
1. 载体取2-5ug，在25ul体系中，用2.5ul的酶切30min-1h，回收载体：
      载体:---2ul（2-5ug）
      酶---------2.5ul
      Buf--------2.5ul
      水---------18ul
回收的时候希望浓度高点。

2. Oligo退火形成双链
   若为2OD=5.4nmol的话，则每个引物用54ul水溶解，即得到浓度为100uM（100pmol/ul）的溶液。
   取两引物各10ul，10X NEB Buf-2取2.2ul，混匀，PCR仪缓慢退火至室温（>60min）。
   程序如下：
   95℃--------5min；
   94~46℃--降1℃/min
   46~26℃--降2℃/min
   4℃---------forever

3. linker的5’端磷酸化
      退火产物-------------0.5ul (50pmol总5’末端)
      10x PNK Buf A-------2ul
   10mM ATP------------2ul
   T4 PNK酶------------1ul
   ddH2O----------------14.5ul
  以上总计20ul，混匀（不可votex），37度30min。

4. 连接
T4 DNA ligase法
        酶切过载体----------100-200ng
        磷酸化linker--------4ul 1:100稀释后的linker
        T4 酶------------------1ul
        T4 Ligase Buf---------1ul
        PEG4000--------------1ul
       加水补足总体积10ul，混匀，4度过夜。
赞一下 回复此楼
3楼2016-05-08 15:07:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-05-08 15:07:55
1. 载体取2-5ug，在25ul体系中，用2.5ul的酶切30min-1h，回收载体：
      载体:---2ul（2-5ug）
      酶---------2.5ul
      Buf--------2.5ul
      水---------18ul
回收的时候希望浓度高点。

2. Olig ...

1号是磷酸化后，没有稀释就连入载体的，转化；
2号是磷酸化后，1:100稀释就连入载体的，转化；
3号是酶切后的载体转化；
4号是载体原质粒转化
构建shRNA慢病毒，引物退火程序怎么设定？
退火形成双链连入载体.jpg
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2016-05-08 15:11:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

永远一片天

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-05-08 15:07:55
1. 载体取2-5ug，在25ul体系中，用2.5ul的酶切30min-1h，回收载体：
      载体:---2ul（2-5ug）
      酶---------2.5ul
      Buf--------2.5ul
      水---------18ul
回收的时候希望浓度高点。

2. Olig ...

你好，我发表了一个求助，你可以帮忙解答一下吗？谢谢啦，你的QQ号是多少？
赞一下 回复此楼
5楼2016-05-27 11:59:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡飞燕

新虫 (初入文坛)
有没有人能够告诉我一下，为什么加了T4Ligase后，阻抗急剧变小
赞一下 回复此楼
6楼2016-07-19 21:18:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

苏小拙

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-05-08 15:07:55
1. 载体取2-5ug，在25ul体系中，用2.5ul的酶切30min-1h，回收载体：
      载体:---2ul（2-5ug）
      酶---------2.5ul
      Buf--------2.5ul
      水---------18ul
回收的时候希望浓度高点。

2. Olig ...

求教：一定要做5’端磷酸化这一步吗？退火之后直接连接效果会怎么样？
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2018-11-08 10:09:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 苏小拙 at 2018-11-08 10:09:56
求教：一定要做5’端磷酸化这一步吗？退火之后直接连接效果会怎么样？...

不一定。如果你载体上有磷，片段就不需要磷酸化。效果可以的。
赞一下 回复此楼
8楼2018-11-08 15:24:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 永远一片天 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 281求调剂 +4 2026计算机_诚心 2026-03-01 7/350 2026-03-01 17:20 by 2026计算机_诚心
[考研] 321求调剂一志愿东北林业大学材料与化工英二数二 +4 虫虫虫虫虫7 2026-03-01 7/350 2026-03-01 16:52 by caszguilin
[考研] 0856材料求调剂 +4 麻辣鱿鱼 2026-02-28 4/200 2026-03-01 16:51 by caszguilin
[考研] 化工专硕342，一志愿大连理工大学，求调剂 +3 kyf化工 2026-02-28 4/200 2026-03-01 16:49 by yywzz
[考研] 0856调剂 +4 刘梦微 2026-02-28 4/200 2026-03-01 15:35 by 吸一口猫气
[考研] 307求调剂 +5 wyyyqx 2026-03-01 5/250 2026-03-01 15:21 by Fff-1
[考研] 295复试调剂 +3 简木ChuFront 2026-03-01 3/150 2026-03-01 14:27 by zzxw520th
[考研] 284求调剂 +6 天下熯 2026-02-28 6/300 2026-03-01 14:19 by Ducount.Y
[考研] 材料284求调剂，一志愿郑州大学英一数二专硕 +10 想上岸的土拨鼠 2026-02-28 10/500 2026-03-01 14:12 by yc258
[考研] 302材料工程求调剂 +4 Doleres 2026-03-01 5/250 2026-03-01 11:52 by liqiongjy
[考研] 调剂 +3 简木ChuFront 2026-02-28 3/150 2026-03-01 11:46 by 王伟要上岸啊
[考研] 317一志愿华南理工电气工程求调剂 +6 Soliloquy_Q 2026-02-28 11/550 2026-03-01 11:14 by 歌liekkas
[论文投稿] 求助coordination chemistry reviews 的写作模板 10+3 ljplijiapeng 2026-02-27 4/200 2026-03-01 09:07 by babero
[考研] 298求调剂 +5 axyz3 2026-02-28 5/250 2026-03-01 06:45 by 刘兵
[考研] 272求调剂 +4 田智友 2026-02-28 4/200 2026-03-01 06:43 by 刘兵
[基金申请] 面上模板改不了页边距吧？ +5 ieewxg 2026-02-25 6/300 2026-03-01 00:10 by addressing
[考研] 307求调剂 +4 73372112 2026-02-28 6/300 2026-03-01 00:04 by ll247
[考研] 085600材料工程一志愿中科大总分312求调剂 +8 吃宵夜1 2026-02-28 10/500 2026-02-28 20:27 by L135790
[考研] 0856材料求调剂 +10 hyf hyf hyf 2026-02-28 11/550 2026-02-28 18:50 by 无际的草原
[考研] 265分求调剂不调专业和学校有行学上就 +4 礼堂丁真258 2026-02-28 6/300 2026-02-28 16:18 by 求调剂zz
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭