应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 5'粘性末端的片段加A尾，做TA克隆
51/1返回列表
查看: 3651  |  回复: 5
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

rrrhm

新虫 (初入文坛)

[求助] 5'粘性末端的片段加A尾，做TA克隆已有2人参与

最近拿有一个天然质粒，用三种酶随机切，切了之后跑胶确定被酶切成了不同的片段。之后要做TA克隆，想给片段加A尾。因为我用的酶切出来之后都是带有5'突出末端，所以想知道，要是加A尾的话，是不是直接用TAQ酶加A尾就行了呢？
因为taq酶具有5'-3'的聚合酶活性，可以将5'粘性末端补平，最后在3'端加A尾，不知道这样行不行？
另外，想问一问，在做TA克隆转化步骤中，酶切灭活后，加A尾时需要纯化酶切片段吗？加了A尾之后也需要纯化片段吗？
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼2018-01-15 12:10:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rrrhm

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-01-15 12:30:58
首先，Taq酶可以加尾，其次，加尾后用PCR纯化试剂盒纯化就行，不用切胶回收

你好，请问，我酶切后跑胶确认片段切开了，80℃灭活5min，这个体系需要纯化了再加TAQ酶吗？还是说灭活体系直接加TAQ酶对加A尾没有影响呢？
赞一下 回复此楼
4楼2018-01-15 12:59:26
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答

渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
rrrhm: 金币+2, ★★★很有帮助 2018-01-15 13:08:42
首先，Taq酶可以加尾，其次，加尾后用PCR纯化试剂盒纯化就行，不用切胶回收

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
2楼2018-01-15 12:30:58
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
rrrhm: 金币+3, ★★★很有帮助 2018-01-15 13:13:41
1. taq酶可以补平加A
2， 需要纯化，主要是去掉taqbuffer，换成连接酶buffer
赞一下(1人) 回复此楼
Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
3楼2018-01-15 12:47:25
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rrrhm

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-15 12:47:25
1. taq酶可以补平加A
2， 需要纯化，主要是去掉taqbuffer，换成连接酶buffer

你好，请问，我酶切后跑胶确认片段切开了，80℃灭活5min，这个体系需要纯化了再加TAQ酶吗？直接加TAQ酶对加A尾有影响吗？
另外，加A尾这个步骤还需要94℃2min来预变性吗？还是只用72℃ 10min就好呢？
赞一下 回复此楼
5楼2018-01-15 13:13:27
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 SCI英文润色翻译-EnPapers美团队-先修改后付款
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 求能源类，故障诊断，机器学习结合的EI期刊。 36+3 wj0318 2024-05-19 5/250 2024-05-22 22:05 by 知识产权服务
[基金申请] 化学B口多少分能上会呀 +4 WOWO159357 2024-05-22 8/400 2024-05-22 21:26 by bingyulin3
[硕博家园] 蹲一个男朋友 +26 伊伊莎贝拉 2024-05-17 49/2450 2024-05-22 20:08 by 无名心水
[有机交流] 两个产物点爬小板离得非常近，怎么靠大板提纯 5+6 lljcb 2024-05-18 7/350 2024-05-22 16:35 by DAXIAOZHI
[教师之家] 博士去高校就是为了有寒暑假吗？ +23 wenwen0825 2024-05-16 29/1450 2024-05-22 15:57 by iwdw2012
[基金申请] 审不上青基又非升即走的青椒 和 牢里踩缝纫机的犯人哪个活的更舒服一点？ +17 非非飞远了 2024-05-20 20/1000 2024-05-22 15:00 by 尘落小窝
[基金申请] 又有两个中科院三、四区计算机领域SCI/SSCI期刊爆出问题了！ +4 瞬息宇宙 2024-05-19 6/300 2024-05-22 12:37 by yp_nupt
[论文投稿] 关于通讯作者 5+3 irikiar 2024-05-21 3/150 2024-05-22 11:21 by bobvan
[硕博家园] 2024/2025碳纳米材料方向博士/科研助理申请 +4 小二仙 2024-05-21 7/350 2024-05-22 09:51 by 呼呼一哈黑
[教师之家] 白天不懂夜的黑，90后青椒与60后老板 +6 zylfront 2024-05-18 7/350 2024-05-22 09:28 by songwz
[基金申请] 太诡异了，五月底还有没有送审的。。 +12 hdzw9071 2024-05-21 12/600 2024-05-21 12:43 by dxcharlary
[论文投稿] SENSORS AND ACTUATORS B-CHEMICAL 15+4 荣小撇 2024-05-20 4/200 2024-05-21 10:07 by ca0yan9
[硕博家园] 又见奇葩学生，可咋办 +25 appleapple2 2024-05-17 30/1500 2024-05-21 09:13 by qyws
[基金申请] 去年申请基金的评审意见是ChatGPT在国内是禁止的，研究方案中有使用ChatGPT不合理 +4 瞬息宇宙 2024-05-19 4/200 2024-05-21 00:37 by dxcharlary
[考博] 海南大学国家级人才田新龙教授团队氢燃料电池与器件方向招收科研助理 (重点支持方向) +6 Dreammzp 2024-05-17 9/450 2024-05-20 18:40 by Dreammzp
[教师之家] 优秀毕业论文 指导教师，普通老师有希望吗？ +6 河西夜郎 2024-05-17 7/350 2024-05-20 09:36 by 晓目崇
[论文投稿] 推荐转投（ transfer pending）是否有用？ 50+3 lily5289 2024-05-17 7/350 2024-05-19 15:11 by wanghuawei
[论文投稿] 投稿成功后又想撤回 +5 otani 2024-05-16 5/250 2024-05-17 16:02 by topedit
[硕博家园] 五氯化铌怎么溶解啊 +3 南南枝枝 2024-05-17 5/250 2024-05-17 11:37 by ad_fish
[基金申请] 粗大，科研之友提示有一篇10多年前的文章被阅读 +9 babu2015 2024-05-16 11/550 2024-05-16 14:53 by TsolmonZ
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭