应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 5'粘性末端的片段加A尾，做TA克隆
61/1返回列表
查看: 3645  |  回复: 5
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

rrrhm

新虫 (初入文坛)

[求助] 5'粘性末端的片段加A尾，做TA克隆已有2人参与

最近拿有一个天然质粒，用三种酶随机切，切了之后跑胶确定被酶切成了不同的片段。之后要做TA克隆，想给片段加A尾。因为我用的酶切出来之后都是带有5'突出末端，所以想知道，要是加A尾的话，是不是直接用TAQ酶加A尾就行了呢？
因为taq酶具有5'-3'的聚合酶活性，可以将5'粘性末端补平，最后在3'端加A尾，不知道这样行不行？
另外，想问一问，在做TA克隆转化步骤中，酶切灭活后，加A尾时需要纯化酶切片段吗？加了A尾之后也需要纯化片段吗？
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼2018-01-15 12:10:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
rrrhm: 金币+2, ★★★很有帮助 2018-01-15 13:08:42
首先，Taq酶可以加尾，其次，加尾后用PCR纯化试剂盒纯化就行，不用切胶回收

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
2楼2018-01-15 12:30:58
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
rrrhm: 金币+3, ★★★很有帮助 2018-01-15 13:13:41
1. taq酶可以补平加A
2， 需要纯化，主要是去掉taqbuffer，换成连接酶buffer
赞一下(1人) 回复此楼
Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
3楼2018-01-15 12:47:25
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rrrhm

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-01-15 12:30:58
首先，Taq酶可以加尾，其次，加尾后用PCR纯化试剂盒纯化就行，不用切胶回收

你好，请问，我酶切后跑胶确认片段切开了，80℃灭活5min，这个体系需要纯化了再加TAQ酶吗？还是说灭活体系直接加TAQ酶对加A尾没有影响呢？
赞一下 回复此楼
4楼2018-01-15 12:59:26
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rrrhm

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-15 12:47:25
1. taq酶可以补平加A
2， 需要纯化，主要是去掉taqbuffer，换成连接酶buffer

你好，请问，我酶切后跑胶确认片段切开了，80℃灭活5min，这个体系需要纯化了再加TAQ酶吗？直接加TAQ酶对加A尾有影响吗？
另外，加A尾这个步骤还需要94℃2min来预变性吗？还是只用72℃ 10min就好呢？
赞一下 回复此楼
5楼2018-01-15 13:13:27
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by rrrhm at 2018-01-15 13:13:27
你好，请问，我酶切后跑胶确认片段切开了，80℃灭活5min，这个体系需要纯化了再加TAQ酶吗？直接加TAQ酶对加A尾有影响吗？
另外，加A尾这个步骤还需要94℃2min来预变性吗？还是只用72℃ 10min就好呢？...

酶切后你要分离出自己要的片段吧？而且buffer不同，所以最好纯化。直接加taq可能没活性
不需要变形，72˚C10min-30min。
赞一下(2人) 回复此楼
Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
6楼2018-01-15 13:22:04
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 rrrhm 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 SCI英文润色翻译-EnPapers美团队-先修改后付款
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 申请基金代表性成果 +11 lancet0903 2024-05-17 11/550 2024-05-18 13:37 by pinyuan33
[考博] 海南大学田新龙教授课题组招24级博士生或科研助理 (氢燃料电池与器件，重点支持方向) +4 Dreammzp 2024-05-17 5/250 2024-05-18 12:26 by 学术渣渣神
[基金申请] 基金委也是打工的 +19 wsjing 2024-05-16 22/1100 2024-05-18 12:05 by 雪径踏青
[硕博家园] 民办高校入职后稳定吗？ +8 905452934 2024-05-16 13/650 2024-05-18 06:54 by dong5391
[考博] 想被211以上高校课题组接收 +7 风起沧澜 2024-05-16 9/450 2024-05-17 16:39 by zhaojiang427
[基金申请] 青基 +3 变成超人 2024-05-15 4/200 2024-05-17 12:42 by ssxclkj
[硕博家园] 海外博士，国内博后找工作求建议 +7 905452934 2024-05-16 17/850 2024-05-17 12:41 by 905452934
[硕博家园] 领养小孩 +15 Yyds55 2024-05-14 15/750 2024-05-17 09:53 by 田园1983
[基金申请] 数理学部函评几号结束？ +6 科研孤勇者 2024-05-16 6/300 2024-05-17 08:49 by hudf03
[基金申请] 系统导出申报书中参与人那一页的格式，跨入两页，要通过调整行间距调整到一页吗？ +3 danisha 2024-05-15 5/250 2024-05-16 18:21 by danisha
[基金申请] 12个本子最多让给1a2b +16 地球e村长 2024-05-13 19/950 2024-05-16 17:48 by sars518
[基金申请] 粗大，科研之友提示有一篇10多年前的文章被阅读 +9 babu2015 2024-05-16 11/550 2024-05-16 14:53 by TsolmonZ
[教师之家] 谁要做个人网站，可以交流啊！ +10 hjc404 2024-05-14 27/1350 2024-05-16 13:39 by hjc404
[硕博家园] 求助，请问我是否该转专业 +8 ygcbl 2024-05-12 10/500 2024-05-16 09:18 by 清晨和风一起
[硕博家园] 导师这样说到底有没有机会啊……… +7 理科生yes 2024-05-14 14/700 2024-05-15 18:45 by 理科生yes
[基金申请] 评审规则突发奇想 +18 平凡冰雪花 2024-05-13 23/1150 2024-05-15 15:54 by 平凡冰雪花
[考研] 求考研导师(24年底我才考，材料类，提前联系) +5 笑笑宝公主 2024-05-12 6/300 2024-05-15 10:53 by 13096145
[有机交流] 无水硫酸钠除水 50+4 桃桃PXS 2024-05-13 4/200 2024-05-14 17:46 by 小肉干
[考博] 韩国成均馆大学 软物质杂化材料研究室 Koo Chong Min 教授课题组 诚招博士生 +5 NWPUGZG 2024-05-13 9/450 2024-05-13 16:40 by NWPUGZG
[考博] 24/25申博，科研助理找导师 +9 cc毕业了吗 2024-05-12 9/450 2024-05-13 14:31 by zxl_1105
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭