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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » EMSA/ChIP » 关于RNA IP 试验中洗脱蛋白的问题
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zlq5192021

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于RNA IP 试验中洗脱蛋白的问题 已有1人参与

最近一直很困惑，希望各位大牛指引

用生物素标记的RNA probe 做IP，用Promega的磁珠调取复合体，之后想要检测蛋白（直接western blot 或者 跑胶染色），蛋白应该怎么洗脱？？？

1、 有文章写到用biotin elution buffer洗脱 (12.5 mM biotin [Invitrogen], 7.5 mM HEPES [pH 7.5], 75 mM NaCl, 1.5 mM EDTA, 0.15% SDS, 0.075% sarkosyl, and 0.02% Na-Deoxycholate)，之后用TCA进行纯化，但是我从生工买的 biotin很难溶解，invitrogen的又太贵，有没有好的建议？
2、考虑到前面要洗脱又要纯化等步骤，损失大，因为我只是要检测用，应该不需要蛋白活性，所以在想能不能直接用SDS-PAGE loading buffer 加到磁珠中直接洗脱蛋白，然后煮沸后上样？？？？

在第二个问题上纠结很久了，自己有尝试做过，如果SDS-PAGE loading buffer 加到磁珠一起煮沸会有很多很亮的非特异带，不知道各位坛友大牛们有没有好的建议和见解？
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1楼 2016-02-24 16:41:50
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zlq5192021

新虫 (初入文坛)
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发自小木虫IOS客户端
2楼2016-02-26 11:44:55
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yanyanyuyu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
也可以考虑使用50mM glycine， pH2.7作为洗脱液，某些抗体和Protein A的结合能力很强，在pH2.7时洗脱效果不太理想，可以使用50mM glycine， pH1.9作为洗脱液。
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3楼2016-02-26 14:27:11
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