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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助！荧光法测定Gus（β－葡萄糖苷酸酶）活性测定
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dailiang

木虫 (正式写手)

[交流] 求助！荧光法测定Gus（β－葡萄糖苷酸酶）活性测定

我要用荧光法测定gus活性，依照《植物基因工程》（王关林主编）上的方法。但是没有买到4-甲基伞形酮钠盐，只能买到4-甲基伞形酮（4-MU）。请问各位大侠应该如何配制4-MU的标准溶液用于绘制标准曲线？
请各位高手不吝指教！
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1楼 2008-10-08 16:39:14
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juliahq

铜虫 (小有名气)
★ ★
司马诸葛(金币+2,VIP+0):谢谢交流 7-26 08:53
引用回帖:
Originally posted by dailiang at 2008-10-8 16:39:
我要用荧光法测定gus活性，依照《植物基因工程》（王关林主编）上的方法。但是没有买到4-甲基伞形酮钠盐，只能买到4-甲基伞形酮（4-MU）。请问各位大侠应该如何配制4-MU的标准溶液用于绘制标准曲线？
请各位高手 ...

不知道你买的4-甲基伞形酮（4-MU）分子量是176的么？我曾经比较了用它和分子量为198.2的（sigma，M1508）4-甲基伞形酮钠盐做标准曲线（浓度梯度一样），测定出来的结果，两者一定偏差（偏差大小没有超出1％），不过我因为有M1508就没有用，我实验室之前的师兄都是用它做标准曲线的，你要是用应该没有问题的。
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2楼2008-10-08 19:05:50
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dailiang

木虫 (正式写手)
谢谢楼上的同学！
我买的4-MU是分子量176的。您说到“我实验室之前的师兄都是用它做标准曲线的”这里面的它是指4-MU么？另外，您当时是用什么样的溶剂和方法配制的4-MU标准溶液呢？谢谢！

[ Last edited by dailiang on 2008-10-9 at 09:00 ]
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3楼2008-10-09 08:57:57
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juliahq

铜虫 (小有名气)
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司马诸葛(金币+3,VIP+0):谢谢交流 7-26 08:53
引用回帖:
Originally posted by dailiang at 2008-10-9 08:57:
谢谢楼上的同学！
我买的4-MU是分子量176的。您说到“我实验室之前的师兄都是用它做标准曲线的”这里面的它是指4-MU么？另外，您当时是用什么样的溶剂和方法配制的4-MU标准溶液呢？谢谢！

[ Last edited by  ...

网上查到4-MU（分子量176)的物理性质是溶于水的，我配成1mM/L的母液时发现不能完全溶掉，实验室其他人没有用完的也是水溶解的，却是完全溶解的，可能我用的是一般的蒸馏水的缘故，当时我还对它的白色粉末过敏了！用M1508的时候也是用水溶的，不过我用stop buffer（无水碳酸钠）也配过是可以溶解的，你可以分别用水或者stop buffer试下，比较一下所作曲线的差异吧。结果就好。
     1mM/L4-MU母液的配制：
   称取4-methylumbelliferone（甲基伞形铜钠盐，MW=198.20），简称4-MUpowder19.8mg溶于100ml蒸馏水，4℃冰箱避光保存。   
1uM（微摩尔）4-MU母液的配制：
取1mM/L 4-MU 的10ul 溶于10ml蒸馏水，4℃冰箱避光保存。
标准曲线我做过两个浓度的：
按下表配制4-MU梯度浓度液：
4-MU母液浓度  4-MU母液吸取体积        反应终止液体积ml        4-MU梯度浓度
         1mM/L        100ul               0.9                          100 uM/L
         1mM/L        100ul               9.9                           10 u M/L
         10uM/L        100ul               0.9                           1 uM/L
         10uM/L        100ul               9.9                           100 nM/L
   以反应终止液为空白对照，测定这四种浓度液的荧光值，将荧光值对4-MU梯度浓度绘制标准曲线。操作步骤参看DyNA Quant200荧光测定仪的使用说明。
或者按照仪器使用说明做：
碳酸钠溶液ml  1微摩尔4-MU（ul微升）    4-MU终浓度（nM）
    2.0                    0                                     0
    1.9                  100                                  50
    1.8                  200                                 100
    1.7                  300                                 150
    1.6                  400                                 200
测定时取上述浓度溶液100ul加入1.9ml的0.2M碳酸钠混匀后测定荧光值，或者在其他荧光光度计上100ul加200ul碳酸钠混匀测定。
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4楼2008-10-09 11:44:40
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dailiang

木虫 (正式写手)
多谢楼上的“juliahq”同学！
我查到有公司讲：4-MU溶于碱性溶液。
可能就是您讲的用stop buffer进行配制。
我来试一下，谢谢！
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5楼2008-10-10 15:16:30
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