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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求教酶切连接问题
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brightfuture01

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[交流] 求教酶切连接问题

我在构建一个宏基因组文库,经过DNA提取,纯化,Sau3AI酶切后回收纯化2-9kb的片段.pbluescript载体BamH1酶切去磷酸化后连接,电转化,但是总是空板,没东西长出来.测定过感受态(DH5)转化率也在10的7次以上.
     连接反应是体系是20ul:
     DNA1.2ul
     载体0.4ul
     buffer 2 ul
     T4 1.2ul
     补水至20ul
     16度过夜连接.
   因为DNA片段的多样性,没法判定 DNA和载体的摩尔比,所以就按照质量比3:1(120ng:40ng)来加.最后电转.转了几次啥都没有长啊.



请教哪里出问题了啊?

[ Last edited by brightfuture01 on 2008-10-8 at 10:24 ]
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
1楼 2008-10-08 09:50:57
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
顶起,大家有经验的帮帮忙啊
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2008-10-08 10:24:21
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zhongdianshi

银虫 (小有名气)
去磷酸化有时影响连接效率.酶的用量要少,并且彻底去掉它的活性,有的用蛋白酶K.因为你的载体一次制备很多,取一点检测一下,用个已知的BAMHI片段(比如有两个切点的质粒)往里插插.载体的问题解决了,再来讨论.好运!
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2008-10-8 09:50:
我在构建一个宏基因组文库,经过DNA提取,纯化,Sau3AI酶切后回收纯化2-9kb的片段.pbluescript载体BamH1酶切去磷酸化后连接,电转化,但是总是空板,没东西长出来.测定过感受态(DH5)转化率也在10的7次以上.
     连接反 ...

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3楼2008-10-08 12:51:54
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
有时候不是没转进去，而是没连上……
连接的建议参考楼上咯，呵呵，说得很清楚
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4楼2008-10-08 12:54:29
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lzx08

建议提高载体和DNA片段的浓度，浓度低也是很难连接上的。
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5楼2008-10-16 15:04:19
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