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brightfuture01木虫之王 (文坛精英)
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求教酶切连接问题
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我在构建一个宏基因组文库,经过DNA提取,纯化,Sau3AI酶切后回收纯化2-9kb的片段.pbluescript载体BamH1酶切去磷酸化后连接,电转化,但是总是空板,没东西长出来.测定过感受态(DH5)转化率也在10的7次以上. 连接反应是体系是20ul: DNA1.2ul 载体0.4ul buffer 2 ul T4 1.2ul 补水至20ul 16度过夜连接. 因为DNA片段的多样性,没法判定 DNA和载体的摩尔比,所以就按照质量比3:1(120ng:40ng)来加.最后电转.转了几次啥都没有长啊. 请教哪里出问题了啊?  [ Last edited by brightfuture01 on 2008-10-8 at 10:24 ] |
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