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链霉菌的 DNA 提取 已有1人参与
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毕设，老板让提取链霉菌的 DNA 送去公司进行全基因组测序。先按照下面 protocal 做了，感觉细胞壁很厚无法破壁，第六步时压根看不到 DNA 析出，跟我一起的同学提另一株菌（也是链霉菌）用同样方法却做出来了。我的菌生长很快，不加甘氨酸一天就到对数期，加0.15%的甘氨酸也只要两天；他的菌需要三四天才能长好，而且需要静止培养。 """ 1 菌体的收集：将液体培养的菌体先静置直至出现分层，把上清液倒掉，倒入无菌水浸泡，待分层后倾去上清液，反复几次，直至菌体变白，上清液几乎和水一样为止。将菌体3000 r/min低速离心，即得到下一步用的湿菌体； 2 用5 mL的SET缓冲液（含20 mmol/L Tris·HCl，pH 7.5，25 mmol/L EDTA，75 mmol/L NaCl）重悬菌体，加100 μL的溶菌酶溶液，37 °C水浴30-60 min。溶菌酶的终浓度是1 mg/Ml； 3 加140 μL的蛋白酶K溶液，混匀，加600 μL的10 %的SDS，颠倒混匀，55 °C 水浴2 h，其间不时地颠倒，一般10 min左右颠倒一次。蛋白酶K的终浓度 0.5 mg/mL，SDS 终浓度1 %; 4 加2 mL 5 M NaCl，上下颠倒彻底混匀，冷却到37 °C。NaCl的终浓度1.25 M。加5 mL的氯仿，在20 °C颠倒混匀30 min; 5 4500 r/min 20 °C离心15 min; 6 将上清液转到一个新管(15ml离心管)中，加0.6倍体积的异丙醇并不断上下颠倒混匀，当看到DNA析出后，把多余的液体倒掉，用75 %的乙醇冲洗DNA，再用无水乙醇来洗，最后风干，然后在55 °C水浴将DNA溶解在1-2 mL的ddH2O（或TE）中; 7 加入RNase至20 μg/mL，37 °C水浴保温30 min; 8 加入一倍体积的氯仿 : 异戊醇（24 : 1）轻摇混匀后，8000 r/min离心10 min; 9 将上清液转移到一个新的离心管中，加入一倍体积的异丙醇，轻摇混合后，将沉淀出的DNA挑取到一个新的离心管中，用10 mL 70 %的乙醇洗涤两次，吹干后装入离心管置于-20 °C保存备用; """ 我又试了液氮研磨+CTAB法，但是还是提取不出来。 求助各位大神还有什么别的方法吗，或者可以怎么改进。 |
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