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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒双酶切后需要去磷酸化吗？
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wj2423311236

银虫 (小有名气)

[求助] 质粒双酶切后需要去磷酸化吗？ 已有1人参与

如题，双酶切后质粒需要去磷酸化吗？我一般酶切完毕后直接加cip酶和buffer，这样有没有影响？
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1楼 2016-01-15 12:56:33
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我从来没有去磷酸化过……
双酶切黏性末端不同，自连是肯定不会的，但就是担心切下来的小片段会重新连回去。
酶切后要纯化或者胶回收，此时会去除一部分小片段……
并且，连接时目的基因的数量比这些小片段多很多，因此大多数连接产物还是正确的。

要注意的一点是：质粒双酶切效率不可能百分之百，因此切后还是有没有切开的质粒，这些质粒会在后续连接转化后形成单克隆，影响连接效率，所以质粒酶切后跑电泳一定要加空白对照，并且质粒酶切不宜加太多。
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2楼2016-01-15 13:43:33
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