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足下客

木虫 (正式写手)

[交流] 电转后的质粒明显变小是怎么回事?

我构建了一个大小约5.4kb的质粒,电激转化入了我们实验室保藏的一株菌中,结果抽提质粒后再跑电泳,发现质粒明显变小了。但是确实是转进去了。
因为我构建质粒时用了这株菌内生性质粒上的两个基因,师姐说可能是发生了基因的双交换。但是这个内生性质粒的拷贝数是极低的,小量抽提质粒,跑电泳甚至看不到条带。
请教各位高手,出现这种情况还有没有其他原因?
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sumertansy

铜虫 (小有名气)

用原来质粒上的酶切位点鉴定下,
2楼2008-09-28 11:38:37
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)

最简单的方法 做个菌液pcr鉴定一下
3楼2008-09-28 11:45:50
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足下客

木虫 (正式写手)

无法进行双酶切鉴定,这个菌的质粒非常难抽提,离心时上清液中总是有悬浮物,抽提后跑电泳的条带都很浅。所以酶切过后就看不到东西了。
菌液PCR本身结果就不清楚,也不适用于我这株菌。
我现在就是想分析一下质粒变小的原因,除了与内生性质粒发生了基因的双交换之外,还有哪些可能。PS:这个质粒转入大肠杆菌中是能够稳定的复制的,而且抽提后的效果也非常好
4楼2008-09-28 12:23:41
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sumertansy

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 足下客 at 2008-9-28 12:23:
无法进行双酶切鉴定,这个菌的质粒非常难抽提,离心时上清液中总是有悬浮物,抽提后跑电泳的条带都很浅。所以酶切过后就看不到东西了。
菌液PCR本身结果就不清楚,也不适用于我这株菌。
我现在就是想分析一下质 ...

你是用质粒直接电泳?
如果这样就不好判断了,就算和对照质粒比在胶上小了,也不好说明问题
5楼2008-09-28 12:36:57
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足下客

木虫 (正式写手)

楼上说的有道理,但是是小了很多呀,还是很明显的,所以应该不是误差
正在考虑要不要测序。
不过我觉得用试剂盒抽提质粒还好啊,一般只有一条带,效果不错
6楼2008-09-28 16:08:53
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xipha

木虫 (正式写手)

找一个单切位点切成线状再跑跑看
7楼2008-09-28 21:07:54
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Hsiaoming

铜虫 (小有名气)

怎么看不明白啊。晕晕的!太高深了
8楼2008-11-04 09:14:55
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yelitao1983

银虫 (小有名气)

你的情况可能有两种:一种是电转时电机杯没洗干净,被其他质粒污染了。一种是你的菌株有问题!确实发生了基因的双交换,不知你用的是什么菌株,什么质粒。我构建过一个4.8kb的质粒,提出来后变成了2KB,后来酶切鉴定是染了T载体杂质粒。为了解决这个问题你可以手工中提一下质粒,多找几个酶切位点鉴定一下,是假的我想一定能鉴定出来。
9楼2008-11-04 10:28:25
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