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anhaishan木虫 (正式写手)
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[求助]
Tail-PCR交流已有1人参与
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| 有做过TAIL-PCR的小伙伴没，最近在用Tail-PCR查找某基因的启动子，但第二轮和第三轮产物，均为弥散条带 （这里就不上图了），连续做了将近一个月了，一直是这样的结果，不知问题出在哪里，望高手指点 |
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 核酸方面 |
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anhaishan
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送红花一朵
5楼2016-01-05 11:01:50
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How many arbitrary primers did you test in combination with a set of gene-specific primers? "The use of large number of 10 mers increases the probability of amplifying long target sequences." For isolation of the 5'-flanking regions of Pal gene, ten of the 16 arbitrary primers resluted in amplification of discrete PCR products. For isolation of the 5'-flanking region of the Pgi gene, only five of the 16 arbitrary primers were found to result in the desired products. |
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2015-12-30 21:51:54, 288.51 K
2楼2015-12-30 21:52:58
anhaishan
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3楼2016-01-04 15:46:03
【答案】应助回帖
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一定要将基因组纯化之后再进行第一轮pcr，第一轮产物可能没有条带，或者条带严重拖尾，这属于正常现象，然后将第一轮产物稀释不同的倍数（20/100／500／1000）进行第二轮扩增，再将第二轮中有条带的产物进行稀释再进行第三轮。同时可以提高退火温度和增加延伸时间来增加特异性。两个月前做过，注意，加样一定要在冰上加，用qpcrmix可以减少加样的误差，提高实验的成功率。加油了，希望能对你有帮助 发自小木虫Android客户端 |
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4楼2016-01-04 22:19:16
50