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【求助】免疫组化技术
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我做的实验，现在要用到免疫组化的技术，想请各位高手帮忙看看应该怎么做。大概是这样的：我首先将量子点与生物素连接起来（B），其中的量子点是有荧光的，可以当成是荧光染料；又将抗体与亲和素连接起来（A）。利用抗体能识别抗原、生物素与亲和素特异性结合的特点，使得量子点能最终标记到抗原上。这有点像免疫组化中的ABC法，在网上，书上查到了一些关于ABC方法的实验步骤，但是感觉不是很详细，所以请高手帮忙给指点一下具体的步骤。上面连接物（B）和（A）都已经制备好了。用的抗体是P-gp鼠抗人：单克隆抗体，C494， 适用组织：石蜡切片， 阳性部位：胞膜/胞浆 ， 预处理：高温修复(柠檬酸)。 我所查到的实验步骤： 固定、包埋、切片、就不说了，都是与免疫组化一样的，关键是染色这步： 染色： 第一天 1.常规切片脱蜡, 进水 1xPBS 10 min x3 2.抗原修复 微波炉 高压 酶 3.血清封闭 RT 30－45min mouse monoclonal IgG, use Horse serum for blocking rabbit polyclonal IgG, use Goat serum for blocking 4.一抗 4度冰箱过夜 第二天 5.PBS 5 min x3 6.二抗 37度湿盒中 30 min 7.PBS 5 min x 3 8.封闭内源性过氧化物酶 RT 20 min 9ml of 31% H2O2 in 150 ml of 100% methanol 9.PBS 10 min x 3 10.ABC复合物 37度 45 min ABC复合物要在配制30分钟后使用 11PBS 5 min x 3 12.DAB 显色 DAB的浓度为 0.05% 13. 复染 存在的问题： 1）血清封闭：要用什么血清，是不是非得用鼠血清。 2）在这个方法里存在有第一级抗体，我的实验中没有，是不是直接略过这步就可以了。 4）我实验中制备的（A）相当于上面步骤中的ABC复合物，但是我的直接是有荧光的，拿到紫外灯照一下就可以看到荧光了。就不需要显色了。 5）复染是什么意思。 6）封闭内源性过氧化物酶也需要么？ 7)整个过程是否都要在无菌状态下进行？ [ Last edited by liujy870 on 2008-9-25 at 08:31 ] |
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3楼2008-09-25 09:34:10
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谢谢各位高手的回答，我是纯搞化学的人，现在用到生物的东西真的有点无从下手啊，幸好有大家帮忙。谢谢！！！！再次感谢！！！！！ 那个血清买牛血清就可以了吗？ 我看网上有好多种类的牛血清，新生牛血清(Newborn Calf Serum) ，透析胎牛血清(Dialyzed FBS) ，热灭活新生牛 ，热灭活优级胎牛血清(Heat Inactivated FBS) ，去钙胎牛血清Calcium Stripping FBS ，Gibco胎牛血清（Certified FBS,美国来源） ，gamma照射优级胎牛血清Gamma Irradiation FBS ，补铁胎牛血清Iron Supplementation FBS ………………好多啊，到底哪种可以啊？ [ Last edited by liujy870 on 2008-9-25 at 16:44 ] |
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