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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » western blot 转印不充分
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shaka2001

金虫 (正式写手)

[交流] western blot 转印不充分

我做66KD的蛋白，sds-page电泳用4%浓缩胶，10%分离胶，分离效果不错；

转印缓冲液：Tris-base 3.03 g，甘氨酸 14.4 g，甲醇200ml，蒸馏水定容至1000ml；
转印条件：湿转，恒压100V，60min（曾经用过100V，120min，结果一样）；

转印完毕后，用丽春红给纤维素膜染色，考马斯亮蓝给胶染色，结果marker全部转印到纤维素膜上了 ，而蛋白有不少还在胶上（看染色情况，估计得剩一半）。

各位高人，我这是怎么回事啊？

另外，
1. 我在转印以前用转印缓冲液浸泡过硝酸纤维素膜，海绵30min，滤纸，胶15min。是不是与此有关，因为有帖子说胶是不应在转印液中浸泡的。
2. 转印液中是否要加SDS，有资料说湿转法为了增加转印效率可在缓冲液中加0.1%SDS。
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不至天竺终不东移一步以负先心
1楼 2008-09-22 16:50:03
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shaka2001

金虫 (正式写手)
唉！自己顶一下，这年头
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不至天竺终不东移一步以负先心
2楼2008-09-22 22:52:33
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castle9987

银虫 (小有名气)
我也刚开始做，纯粹支持下
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3楼2008-12-28 23:07:55
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader
帮你分析了一下原因
1.蛋白分子量比较大，增加电流或者延长转膜时间
2.蛋白上样量太大，或者蛋白里有尿素之类的物质影响转膜效率，建议透析一下
3.蛋白有不少还在胶上，50kd以上的都会有残留，这个正常
4.胶需要在缓冲液中浸泡，但不要太长时间，跑完电泳立即转膜
赞一下 回复此楼
会当凌绝顶，一览众山小
4楼2008-12-28 23:25:26
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