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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » ClaI酶切重组载体切不开，请问是什么原因啊？！！！急！急！！！
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andyshang

木虫 (小有名气)

[求助] ClaI酶切重组载体切不开，请问是什么原因啊？！！！急！急！！！ 已有2人参与

我的载体经ClaI、XhoI酶切后连进去了一目的片段，测序显示酶切位点没有发生突变，但是我再用ClaI酶切此重组载体时却怎么也切不开了请问各位前辈这是什么原因啊？！
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1楼 2015-12-10 23:09:56
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czfscf

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
andyshang: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-12-15 22:00:48
原因？可能你酶切过程有问题 也可以能你的载体本身有问题 把体系贴出来 人家才能帮你解答
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Ecological Genomics；the scientific walking hormone
2楼2015-12-11 02:06:38
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andyshang

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by czfscf at 2015-12-11 02:06:38
原因？可能你酶切过程有问题 也可以能你的载体本身有问题 把体系贴出来 人家才能帮你解答

20ul的酶切体系，质粒的量是300ng，claI（thermo公司的）的用量是0.3ul,酶切时间是10小时。
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3楼2015-12-12 10:39:39
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肥猫p

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
andyshang: 金币+30, ★★★★★最佳答案 2015-12-15 22:01:17
最大可能是酶切位点被甲基化了。Cla I对Dam甲基化敏感。你看看是不是你连接后，Cla I酶切位点前的一个碱基是G或者酶切位点后的一个碱基是C。
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4楼2015-12-12 21:37:37
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andyshang

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 肥猫p at 2015-12-12 21:37:37
最大可能是酶切位点被甲基化了。Cla I对Dam甲基化敏感。你看看是不是你连接后，Cla I酶切位点前的一个碱基是G或者酶切位点后的一个碱基是C。

恩恩，连接后ClaI酶切位点前的碱基是G，那怎么才能去掉这种甲基化呢？我这个酶切位点后续的实验中还会用到~
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5楼2015-12-12 22:40:54
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肥猫p

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by andyshang at 2015-12-12 22:40:54
恩恩，连接后ClaI酶切位点前的碱基是G，那怎么才能去掉这种甲基化呢？我这个酶切位点后续的实验中还会用到~...

换用甲基化酶缺失的E.coli菌株。或者，重新做克隆，换掉前面的G
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6楼2015-12-13 14:16:15
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)
dam甲基化需要用专门菌株，应该是jm110

发自小木虫Android客户端
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7楼2015-12-13 14:17:51
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andyshang

木虫 (小有名气)
感谢各位的应答，我换了一株Dam-的菌株后，质粒就能被切开了，以后用ClaI的朋友，不妨试试这种方法。
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8楼2015-12-15 22:00:09
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 肥猫p at 2015-12-12 21:37:37
最大可能是酶切位点被甲基化了。Cla I对Dam甲基化敏感。你看看是不是你连接后，Cla I酶切位点前的一个碱基是G或者酶切位点后的一个碱基是C。

你好，我也是用ClaI、XhoI双酶切，我看了你的回复贴才知道ClaI容易被甲基化，问题是现在我的引物就有甲基化位点（CC ATCGAT CGAAAGCTCGTCAGGGT），换dam-Ecoli还能解决问题吗?我应该怎么办呢，折腾一个多月了，拜托拜托
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9楼2016-10-18 11:05:19
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 肥猫p at 2015-12-12 21:37:37
最大可能是酶切位点被甲基化了。Cla I对Dam甲基化敏感。你看看是不是你连接后，Cla I酶切位点前的一个碱基是G或者酶切位点后的一个碱基是C。

你好，我也是用ClaI、XhoI双酶切，我看了你的回复贴才知道ClaI容易被甲基化，问题是现在我的引物就有甲基化位点（CC ATCGAT CGAAAGCTCGTCAGGGT），换dam-Ecoli还能解决问题吗?我应该怎么办呢，折腾一个多月了，拜托拜托
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10楼2016-10-18 11:05:46
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