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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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andyshang

木虫 (小有名气)

[求助] ClaI酶切重组载体切不开,请问是什么原因啊?!!!急!急!!! 已有2人参与

我的载体经ClaI、XhoI酶切后连进去了一目的片段,测序显示酶切位点没有发生突变,但是我再用ClaI酶切此重组载体时却怎么也切不开了请问各位前辈这是什么原因啊?!
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czfscf

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
andyshang: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-12-15 22:00:48
原因?可能你酶切过程有问题 也可以能你的载体本身有问题 把体系贴出来 人家才能帮你解答
Ecological Genomics;the scientific walking hormone
2楼2015-12-11 02:06:38
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andyshang

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by czfscf at 2015-12-11 02:06:38
原因?可能你酶切过程有问题 也可以能你的载体本身有问题 把体系贴出来 人家才能帮你解答

20ul的酶切体系,质粒的量是300ng,claI(thermo公司的)的用量是0.3ul,酶切时间是10小时。
3楼2015-12-12 10:39:39
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肥猫p

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
andyshang: 金币+30, ★★★★★最佳答案 2015-12-15 22:01:17
最大可能是酶切位点被甲基化了。Cla I对Dam甲基化敏感。你看看是不是你连接后,Cla I酶切位点前的一个碱基是G或者酶切位点后的一个碱基是C。
4楼2015-12-12 21:37:37
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andyshang

木虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 肥猫p at 2015-12-12 21:37:37
最大可能是酶切位点被甲基化了。Cla I对Dam甲基化敏感。你看看是不是你连接后,Cla I酶切位点前的一个碱基是G或者酶切位点后的一个碱基是C。

恩恩,连接后ClaI酶切位点前的碱基是G,那怎么才能去掉这种甲基化呢?我这个酶切位点后续的实验中还会用到~
5楼2015-12-12 22:40:54
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肥猫p

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by andyshang at 2015-12-12 22:40:54
恩恩,连接后ClaI酶切位点前的碱基是G,那怎么才能去掉这种甲基化呢?我这个酶切位点后续的实验中还会用到~...

换用甲基化酶缺失的E.coli菌株。或者,重新做克隆,换掉前面的G
6楼2015-12-13 14:16:15
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

dam甲基化需要用专门菌株,应该是jm110

发自小木虫Android客户端
7楼2015-12-13 14:17:51
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andyshang

木虫 (小有名气)

感谢各位的应答,我换了一株Dam-的菌株后,质粒就能被切开了,以后用ClaI的朋友,不妨试试这种方法。
8楼2015-12-15 22:00:09
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饿的神啊

新虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 肥猫p at 2015-12-12 21:37:37
最大可能是酶切位点被甲基化了。Cla I对Dam甲基化敏感。你看看是不是你连接后,Cla I酶切位点前的一个碱基是G或者酶切位点后的一个碱基是C。

你好,我也是用ClaI、XhoI双酶切,我看了你的回复贴才知道ClaI容易被甲基化,问题是现在我的引物就有甲基化位点(CC ATCGAT CGAAAGCTCGTCAGGGT),换dam-Ecoli还能解决问题吗?我应该怎么办呢,折腾一个多月了,拜托拜托
9楼2016-10-18 11:05:19
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饿的神啊

新虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 肥猫p at 2015-12-12 21:37:37
最大可能是酶切位点被甲基化了。Cla I对Dam甲基化敏感。你看看是不是你连接后,Cla I酶切位点前的一个碱基是G或者酶切位点后的一个碱基是C。

你好,我也是用ClaI、XhoI双酶切,我看了你的回复贴才知道ClaI容易被甲基化,问题是现在我的引物就有甲基化位点(CC ATCGAT CGAAAGCTCGTCAGGGT),换dam-Ecoli还能解决问题吗?我应该怎么办呢,折腾一个多月了,拜托拜托
10楼2016-10-18 11:05:46
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