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chenfang20045

金虫 (小有名气)

[交流] 请教各位:双酶切切不开怎么会事?怎么办?

我用kpn1和Hind3双酶切一个质粒,酶切6小时后电泳,总出现一条质粒带,如果能切开,应该是两条带的啊,请问什么原因?如何解决?谢谢!
(因为这个质粒是我构建的的一个质粒,连上了我的一段目的基因,想双酶切验证一下目的基因是否已连上,但总切不开,急!)
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chysx6

铁杆木虫 (小有名气)

从来没用过生工的酶,它们给提供什么样的buffer也不清楚
给你提供下列体系供参考:
1.NEB
Enzyme Supplied NEBuffer % Activity in NEBuffers 1 2 3 4
Hind III  2            50 100 10 50
Kpn I     1 + BSA  100 75 0 50
建议使用buffer2+BSA
2.Takara
在各种Universal Buffer中的相对活性:
                 L      M    H     K    T(+BSA)
Hind III     (60) 100 <20  200   (100)
Kpn I        100  60  <20  <20  (100)
建议使用buffer M

也就是说如果你用生工的酶,应该选择它们提供的中盐buffer进行酶切
应该就是随HindIII提供的那个buffer
11楼2008-09-20 11:32:19
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chysx6

铁杆木虫 (小有名气)

先用两个酶分别做单切,如果都能切开,说明这两个酶是好使的
再与双切的载体部分比较位置,如果位置有差异,说明你的片段被切掉了,
看不见可能是因为量太少的大原因
如果双切位置与单切位置一样,说明有一种酶没发挥效果,建议重新配制体系
2楼2008-09-18 20:52:36
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chenfang20045

金虫 (小有名气)

谢谢!我试一下。
3楼2008-09-18 22:06:51
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chenfang20045

金虫 (小有名气)

谢谢!我试一下。
4楼2008-09-18 22:07:02
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