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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 蓝白斑筛选个别个别白斑均不是阳性克隆。阳性克隆再插入一个片段如何筛选
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Joyceyuan

新虫 (初入文坛)

[求助] 蓝白斑筛选个别个别白斑均不是阳性克隆。阳性克隆再插入一个片段如何筛选 已有1人参与

1.最近在做质粒重组，6800bp质粒插入2000bp的片段，连接后蓝白斑筛选，可是几乎全是蓝斑而且长得很密，偶尔几颗白斑也均不是阳性克隆，请问如何解决？酶切验证没有问题，连接酶也没有问题，具体连接效率如何判断？
    2.如果我已经在质粒上加入了一个片段，经蓝白斑筛选后挑出了阳性克隆，然后我又要在这个重组质粒上插入另一个片段，此时我如何筛选？
求各位帮助，蓝白斑筛选了2个月了没有阳性克隆，这么简单的实验出问题很忧伤。。
P：6800bp的质粒双酶切，2000bp的片段是从另一个DNA上扩增出来的，引物含酶切位点。
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1楼 2015-11-27 22:09:47
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unclefred

金虫 (初入文坛)
建议你看看基于T4 DNA Polymerase的克隆，可以一次性克隆几个片段进一个载体。还有，建议你不要死盯着蓝白斑筛选，这个对于克隆来说不是必须的。做好对照，转化子直接用菌落PCR验证。

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4楼2015-12-01 07:53:51
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unclefred

金虫 (初入文坛)
好好看一下蓝白斑筛选的原理，没有人说插入后一定是白斑。蓝斑也可能是阳性的。

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2楼2015-11-28 07:57:31
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Joyceyuan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by unclefred at 2015-11-28 07:57:31
好好看一下蓝白斑筛选的原理，没有人说插入后一定是白斑。蓝斑也可能是阳性的。

蓝斑和白斑我都挑过克隆，全部是阴性的。。。
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3楼2015-11-30 09:45:28
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fuyulin

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
Joyceyuan: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-12-01 14:52:14
第二个问题是没有筛选标记的情况下，调节好载体和外源片段比例，减少载体用量，用效率高的感受态
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5楼2015-12-01 12:25:03
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