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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » southern blot 相关问题咨询
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若溪

金虫 (正式写手)

[求助] southern blot 相关问题咨询 已有2人参与

我最近在做southern blot，用自己设计的引物进行PCR，纯化后进行地高辛标记，但是在检测标记效率的时候出现了问题，试剂盒里面的说明上说直接把标记好的探针和Control梯度稀释，直接点于尼龙膜上紫外线下交联半小时，然后按照试剂盒说明进行下面的操作，但是显影后X光片上是空白的，什么都没有！我不知道尼龙膜在进行实验之前需不需要活化或是用什么缓冲液浸泡，还有试剂盒还有一个月就过期了，帮别人做的实验，试剂盒运过来的时候是用干冰运过来的，之后4°保存的，不知道试剂盒是否已经失效了！现在很苦恼，实验一直不出结果，请指点一二，不胜感激
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没有比脚更长的路，没有比人更高的山
1楼 2015-11-23 15:21:17
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酒家何处

新虫 (小有名气)
尼龙膜转膜之后要固定的吧。探针结合后要洗脱吧。洗脱之后再用发光夜或者曝光x显示结果的吧。。

发自小木虫Android客户端
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2楼2015-11-23 23:17:24
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shengliding

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
根据Souther杂交原理，DNA分子必须是单链。点到膜上的DNA或者点到膜上的细菌，然后正面朝上要放到滤纸上，滤纸是浸过碱性液的，再转到浸过平衡液的滤纸上，之后交联。这样处理后, 膜上的DNA才能和煮过变性的探针杂交上。祝实验顺利！
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3楼2015-11-24 09:31:12
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若溪

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by shengliding at 2015-11-24 09:31:12
根据Souther杂交原理，DNA分子必须是单链。点到膜上的DNA或者点到膜上的细菌，然后正面朝上要放到滤纸上，滤纸是浸过碱性液的，再转到浸过平衡液的滤纸上，之后交联。这样处理后, 膜上的DNA才能和煮过变性的探针杂交 ...

我现在还没做后续实验呢，刚标记好探针，检测探针的标记效率，还没开始正式实验呢。我用罗氏的试剂盒标记好探针后，试剂盒里面说探针和对照直接点样于尼龙膜，我是问这一步的尼龙膜是否需要特殊处理
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没有比脚更长的路，没有比人更高的山
4楼2015-11-25 11:08:24
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shengliding

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 若溪 at 2015-11-25 11:08:24
我现在还没做后续实验呢，刚标记好探针，检测探针的标记效率，还没开始正式实验呢。我用罗氏的试剂盒标记好探针后，试剂盒里面说探针和对照直接点样于尼龙膜，我是问这一步的尼龙膜是否需要特殊处理...

这一步不需要。
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5楼2015-11-26 08:28:19
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kaqmeiger

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你这个问题还蛮常见的，http://www.ebioq.com/openlab/43/0 我前几天刚看完这个上面的相关资料和实验介绍，感觉还不错，分享一下。祝好运。
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6楼2016-07-07 11:18:03
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