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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求植物中氨基酸各组分含量的测定的方法
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brassica227

铁虫 (小有名气)

[交流] 求植物中氨基酸各组分含量的测定的方法

求植物叶片中氨基酸各组分含量的测定的方法，包括前期样品准备过程、哪种方法、测量过程、实验注意事项等等，越详细越好！先一并谢过！
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1楼 2008-09-16 16:57:53
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

谷类作物种子中赖氨酸含量的测定

★
brassica227(金币+1,VIP+0):我需要一次性从叶片中提取，一次性的测定，比如HPLC或者氨基酸分析仪之类的
蛋白质中赖氨酸（lysine，Lys）的含量是谷物品质的主要指标之一。由于动物及人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的谷物，对于提高营养价值有重要意义。本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料结合法（Dye Binding Lysine，DBL）测玉米种子中赖氨酸含量。

一、茚三酮显色法原理： 谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的ε-NH2，它与茚三酮（ninhydrin）试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质，其颜色与赖氨酸残基的数目成正相关。选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量.

二、材料、仪器设备
（一）材料：不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎，过100目筛子，收集过筛后的细粉，放入广口瓶内，加入沸程60～90℃的石油醚，使其淹过粉面，浸泡8h，不时搅动进行脱脂。然后过滤，并用石油醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液。将脱脂玉米粉晾在干净的滤纸上，置阴凉通风处吹干石油醚。收集干粉，置干燥器内，保存备用。
（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 水浴锅；3. 试管；4. 圆头玻璃棒（圆头大小要与试管大小配套）。
（三）试剂：1. 缓冲溶液，称取30g甲酸钠，溶解于约60ml蒸馏水中，加入10ml8％的甲酸，最后加水到100ml；2.茚三酮试剂，称取1g茚三酮和1g氯化镉（CdCl2.H2O），加入25ml上述缓冲溶液和75ml乙二醇，室温下放置一天，第二天使用。若出现沉淀，则过滤后使用。该溶液一定要头一天配制，第二天使用，不宜放置过久，也不能现用现配；3.4％和2％无水碳酸钠溶液各50ml；4.标准亮氨酸溶液，准确称取25mg亮氨酸，加数滴稀盐酸，待溶解后定容至50ml，该溶液亮氨浓度为500μg/ml。准确吸取上述母液1，3，5，7，9ml，分别稀释至25ml，待用。

三、实验步骤
（一）绘制标准曲线准确吸取已配好的标准浓度系列的亮氨酸溶液各0.5ml，分别放入5支试管中，每种浓度做三个重复。再取一支试管加入0.5ml蒸馏水做空白对照。向每支试管中各加入0.5ml的4％碳酸钠溶液和2ml茚三酮试剂（头一天配好的），混匀，在80℃恒温水浴上保温30min。取出后，立即放入冷水浴中冷却3min，然后向每管内加入5ml的95％乙醇，摇匀，在分光光度计上500nm波长处进行比色，以空白做对照，读取吸光度。以吸光度值为纵座标，亮氨酸浓度为横座标，绘出标准曲线，并求出曲线的斜率。
（二）样品的测准确称取已脱脂的各种玉米种子干粉各25ml，每个品种做三个重复。放入试管中（试管应预先烘干），加入约300mg细石英砂（估计数字）和1ml2％碳酸钠溶液，用圆头玻棒充分搅拌2min，注意切勿将试管挤破，将试管放入80℃恒温水浴中，提取10min，应常搅动。取出试管，向每管内按顺序加入2ml茚三酮试剂，混匀，放入80℃恒温水浴中，保温显色30min，同时以蒸馏水做一空白对照，取出后，立即放入冷水浴中冷却3min，以下步骤与标准曲线做法相同。加完乙醇后进行过滤，用滤液进行比色，读取吸光度。若样品颜色过深，则可取一定量的滤液用95％乙醇稀释后比色，吸光度的数值以在标准曲线范围内为宜。在标准曲线上查出相当的亮氨酸含量。一般作物的籽粒中，蛋白质含量约为干重的10％～20％，富含蛋白的种子中则为30％～50％；赖氨酸含量约为3～7g／16g氮。

四、结果计算按下列公式进行计算：
赖氨酸含量（μg Lys/mg）＝G×2×N/W 。式中：G—为标准曲线上查出的亮氨酸的量（μg／0.5ml）；N—为样品稀释倍数；W—为样品的重量（mg）。
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
3楼2008-09-16 18:00:51
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

脯氨酸含量的测定

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+5,VIP+0):thx
brassica227(金币+2,VIP+0):谢谢，不过你给出的并不是我想要的，因为我需要一次性从叶片中提取，一次性的测定，比如HPLC或者氨基酸分析仪之类的
在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。
一、原理
用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。
（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；5. 大试管；6. 普通试管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。
（三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中；2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。
三、实验步骤
1. 标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。
2. 样品的测定（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。
四、结果计算根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（Xμg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：
脯氨酸含量（μg/g）＝[X×5/2]/样重（g）。
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2楼2008-09-16 18:00:13
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)
★
brassica227(金币+1,VIP+0):我需要一次性从叶片中提取，一次性的测定，比如HPLC或者氨基酸分析仪之类的
谷氨酸含量测定方法：见互助存储区~~~茚三酮比色法测定谷氨酸含量的研究

[ Last edited by 游侠892 on 2008-9-16 at 18:10 ]
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4楼2008-09-16 18:07:51
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