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xy531483760

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

一：退火温度太低
二：模版有可能不纯或者压根没有（建议用没有PCR的做个对照）
三：引物某根的我用的0。5的模版两个都是
四：胶浓度太高了？你做的什么
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比较笨的小虫虫
11楼2015-11-22 20:54:40
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z631535213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by xy531483760 at 2015-11-22 20:54:40
一：退火温度太低
二：模版有可能不纯或者压根没有（建议用没有PCR的做个对照）
三：引物某根的我用的0。5的模版两个都是
四：胶浓度太高了？你做的什么

后来做梯度PCR42-54，每2度一个梯度，，引物终浓度降为0.3uM，结果都有产物。准备今天再把55度重新做一次

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12楼2015-11-23 06:51:43
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z631535213

木虫 (正式写手)
对了，理论产物是100bp

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13楼2015-11-23 06:52:45
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xy531483760

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by z631535213 at 2015-11-23 06:51:43
后来做梯度PCR42-54，每2度一个梯度，，引物终浓度降为0.3uM，结果都有产物。准备今天再把55度重新做一次
...

55度，我感觉太低了，我们一般是62

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比较笨的小虫虫
14楼2015-11-23 08:24:58
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z631535213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by xy531483760 at 2015-11-23 08:24:58
55度，我感觉太低了，我们一般是62
...

不清楚啊  第一次做这个多重PCR 。上周五的实验结果从42到54都有PCR产物，刚重做55°样本，PCR ing。
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15楼2015-11-23 11:39:55
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xy531483760

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by z631535213 at 2015-11-23 11:39:55
不清楚啊  第一次做这个多重PCR 。上周五的实验结果从42到54都有PCR产物，刚重做55°样本，PCR ing。...

加油吧，我们这边退火温度都挺高的
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比较笨的小虫虫
16楼2015-11-23 12:24:36
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淼妖

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
z631535213: 金币+3, ★有帮助, 后来做了梯度PCR,等会把图发上来，请大家帮忙看一下 2015-11-25 16:26:34
计算一下配对的引物温度，不是所有都是55退火。体系没有问题，你扩增基因组DNA?加那么多模板？你扩增产物多长？所用的taq 酶，每分钟合成多长，应该72 延伸多长时间？最适反应温度多少，说明中都应该有，仔细看一下。
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17楼2015-11-23 12:52:26
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风铃永不孤单

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
z631535213: 金币+6, ★有帮助, 循环数是低了，现在调整到了30cycs 2015-11-25 16:27:37
建议提高循环次数，降低DNA上样量，提高退火温度试一下~~~~还有你的琼脂糖电泳时候的电压应该调整一下吧~~~我个人觉得应该是这些问题~~~~
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18楼2015-11-23 15:25:22
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电魂

铜虫 (初入文坛)
你的引物特异性有问题吧，或者模版浓度太低。
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19楼2015-11-23 21:02:28
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酒家何处

新虫 (小有名气)
电泳没啥要求。marker之类的也没啥要求。多跑两遍也一样。就是pcr出问题了。没有目的条带。做个阳性对照确定是不是mix的问题.循环数加到30。引物浓度，模板的量也在接受范围。不是mix的问题就是引物设计的问题了。

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20楼2015-11-23 22:41:51
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