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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 用ＧＥ蛋白纯化仪分离不同分子量的胶原蛋白，求助！！！
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anqier0717

新虫 (初入文坛)

[求助] 用ＧＥ蛋白纯化仪分离不同分子量的胶原蛋白，求助！！！ 已有3人参与

　　大家好，本人新手第一次做蛋白，很多问题都不懂，请大神们不吝赐教。
　　试验目的：用ＧＥ的蛋白纯化仪纯化一批胶原蛋白样品，最终得到纯的相同分子量的蛋白。
　　样品描述：该胶原蛋白样品分子量估计有１０ｋｄ－１８０ｋｄ（有可能更大或更小，实验室的ｍａｒｋｅｒ就这么大的，我只做了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ验证了一下）。
　　
　　我想问大家的问题是：
　　１、我之前用超滤膜过滤，但是效果不好，无论是用０.１μｍ的膜过滤还是１５万Ｄ的膜过滤，总有一段９５KD-72KD的蛋白（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ验证），还有１８０ｋｄ－１３０ｋｄ（６％胶跑出来的）、４３－３４ｋｄ（１２％的胶跑出来的）、１７－１０ｋｄ（１２％和１５％的胶都跑出来了）的条带，但是都不纯。所以才选用蛋白纯化仪纯化，希望能得到纯的相同分子量的蛋白。请问我这个思路是正确的吗？

　　２、要用蛋白纯化仪纯化要选什么柱子，是否需要买脱盐柱？（不确定这些蛋白分子量是否很接近，目前还不知道蛋白ＰＩ）。
　　３、求具体的实验步骤，或者告诉我一些可以学习的教材。

谢谢大家了，目前想到的问题就这些，希望大家一起交流探讨！！！
　　　　
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1楼 2015-11-18 22:09:17
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nadia926499

木虫 (小有名气)
分子筛可以试试，不同的分子筛柱子分离的大小不一样。不过损耗会比较大。

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14楼2015-11-23 00:49:41
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普通回帖

绿枫隽

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的蛋白是一个组分还是多个组分……

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2楼2015-11-18 22:18:40
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anqier0717

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 绿枫隽 at 2015-11-18 22:18:40
你的蛋白是一个组分还是多个组分……

应该是一个组分，就是从动物皮中提取出来的胶原蛋白
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3楼2015-11-18 22:37:53
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a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
anqier0717: 金币+2, ★有帮助 2015-11-20 11:47:02
引用回帖:
3楼: Originally posted by anqier0717 at 2015-11-18 22:37:53
应该是一个组分，就是从动物皮中提取出来的胶原蛋白...

那你这标题“不同分子量的胶原蛋白”是为何？你不确定你的蛋白到底是多大分子量，后续纯化要怎么做？超滤这个一般很难纯化蛋白，试试离子交换柱、分子筛柱子等
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4楼2015-11-19 09:17:31
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wucuixia

捐助贵宾 (著名写手)
0.1微米的膜孔径大了，用分子量5000左右的卷式超滤可以做到

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5楼2015-11-19 10:08:45
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总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
anqier0717: 金币+1, ★有帮助 2015-11-20 11:50:05
根据分子大小来纯化估计不行，类似于分子筛蛋白纯化、凝胶过滤纯化、超滤等等应该不可取，楼主可以用疏水层析、离子柱，先预测试你要的蛋白的特性，然后选择方案。
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我好累，承受这个年纪不该有的帅！
6楼2015-11-19 10:38:49
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绿枫隽

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
anqier0717: 金币+2, ★有帮助 2015-11-20 11:50:19
首先你要确定自己蛋白多大，跑过的电泳看看纯度如何，如果杂蛋白跟你目的蛋白差不多，估计分子筛分不开，可以考虑离子交换……

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7楼2015-11-19 12:45:20
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anqier0717

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by a86052 at 2015-11-19 09:17:31
那你这标题“不同分子量的胶原蛋白”是为何？你不确定你的蛋白到底是多大分子量，后续纯化要怎么做？超滤这个一般很难纯化蛋白，试试离子交换柱、分子筛柱子等...

因为胶原蛋白全胶分子量氛围就是比较大，我是想分出来的蛋白只要在一个范围之内就好，比如40-50.100-120kd的这样就可以。谢谢啦，我现在再看这些柱子，先过分子筛柱子试试吧，
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8楼2015-11-20 11:46:53
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anqier0717

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wucuixia at 2015-11-19 10:08:45
0.1微米的膜孔径大了，用分子量5000左右的卷式超滤可以做到

我现在想的是我们既然有蛋白纯化仪，还是用柱子分吧，不用超滤了，还是谢谢你
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9楼2015-11-20 11:48:03
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anqier0717

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 总有二狗咬朕 at 2015-11-19 10:38:49
根据分子大小来纯化估计不行，类似于分子筛蛋白纯化、凝胶过滤纯化、超滤等等应该不可取，楼主可以用疏水层析、离子柱，先预测试你要的蛋白的特性，然后选择方案。...

分子筛不行吗？我最近还打算用分子筛试一下，只要能分出一个大致范围内的蛋白就好，比如100-120kd。50-60kd的
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10楼2015-11-20 11:49:46
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