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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 急！急！急！！！出现了一个多月的克隆和转化问题，请大家帮帮忙！
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bihailantian

金虫 (初入文坛)

[交流] 急！急！急！！！出现了一个多月的克隆和转化问题，请大家帮帮忙！

1.目的片断1.6k，8月上旬可任意扩增出来，近一个月在同样的体系.程序在同一台PCR仪的的情况下，扩不出目的片断（已经换过新的酶，dNTP,引物等）但是会出现非特异条带，且片断一般在700-1100左右。问题可能出在哪里？（这个问题在前面发的一个帖子里有）

2.用8月初回收的目标片断（1.6k）进行连接（宝生的PMD18-T和solution I）-转化(热激法)- 涂板（氨苄抗性的LB培养基）,37度培养过夜。
随后M13为引物做菌液PCR，看不到目的条带。但对同一个菌落-摇菌-提质粒-双酶切检测，部分菌落呈阳性。为什么菌液PCR检测不到已经转进去的片断？送去几批样品测序也总是失败，公司说没有信号。（7月底测过一次，序列是正确的。）

3.最近一个周克隆一个1.4k，也扩不出来。(8月上旬都可克隆出)，现在模板，引物，酶，dNTP，水等都换了新的，并且换到别的实验室做过也没有出来。今天相同的样品放在2个PCR仪里面，居然都是克隆出的200bp,500bp的两条带，为什么，这两个基因突然克隆不出？这两个基因持续克隆不出来都一个月了，实在想不出原因，请大家帮帮忙把。

[ Last edited by bihailantian on 2008-9-12 at 11:18 ]
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1楼 2008-09-11 17:29:56
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zhouyj

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
bihailantian(金币+4,VIP+0):问题尚未解决，但谢谢您的建议
1、可能是模板问题，模板反复冻隆有时候可能是降解，你可以试试换新的模板，稍微提高一下退火温度，万一不行就切胶回收吧
2、如果菌落PCR程序没问题的话，就想不出原因啦，我曾经也出现过，只能重心连接转化了。
3、同样检查模板，引物是否有问题，如果两个基因是用同一模板扩不出来的话，模板出问题可能性最大
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有朋友们的支持，在学术道路上才不会寂寞
2楼2008-09-11 18:16:55
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
bihailantian(金币+1,VIP+0):特异引物PCR也做了，依旧不行。但谢谢您的建议。
bihailantian(金币+3,VIP+0):特异引物菌液PCR已做，依旧没有结果，谢谢您的建议
用基因特异性引物做菌液PCR检测 看看
可能就是模板出现的问题 看一下模板的量 不要太大
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3楼2008-09-11 19:16:24
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yelitao1983

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
bihailantian(金币+4,VIP+0):水换了，加样地点也换了，还是没有解决问题，模版是DNA，谢谢您的回复
答1：扩出非特异性带极有可能是水有问题，重新换水在超净台内做PCR.
答2：菌液PCR本身就是一种极有可能失败的方法，建议做质粒PCR.
答3：极有可能是模板有问题，可能你的模板已经不是阳性克隆了！
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4楼2008-09-11 19:46:52
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xipha

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
bihailantian(金币+1,VIP+0):是一个厂家的，全套试剂全部换过，包括模版，做了个另外的差不多大小的引物，也做不出来，真是头痛。但还是要谢谢您
bihailantian(金币+3,VIP+0):同上
1、2、3、dNTP和酶是同一个厂家的么？如果不是，有可能扩不出来特异带或降低效率。也可能是10*Buffer坏了，建议换新的。
无论如何，根据陈述，应该是PCR体系出问题的可能性最大。
建议做一个1.5kb左右的一定能扩出来的阳性PCR以确定是否如此。
2、既然PCR体系失败，当然扩不出来，双酶切的可能是杂带

[ Last edited by xipha on 2008-9-11 at 22:23 ]
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5楼2008-09-11 22:21:34
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bihailantian

金虫 (初入文坛)
to 二楼zhouyj兄，

1、可能是模板问题，模板反复冻隆有时候可能是降解，你可以试试换新的模板，稍微提高一下退火温度，万一不行就切胶回收吧（模版已重新提取，退火温度已作了梯度，但依旧克隆不出来）
2、如果菌落PCR程序没问题的话，就想不出原因啦，我曾经也出现过，只能重心连接转化了。（现在是扩增不出来，用以前回收的转化也不成功，转了几次，感受态也换了）
3、同样检查模板，引物是否有问题，如果两个基因是用同一模板扩不出来的话，模板出问题可能性最大 （引物换了新的粉末，前天才稀释的）

[ Last edited by bihailantian on 2008-9-12 at 11:17 ]
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6楼2008-09-12 11:13:53
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bihailantian

金虫 (初入文坛)
to三楼snzydong  
用基因特异性引物做菌液PCR检测 看看（M13和特异引物同时做的，都扩增不出来，第一批转化成功的时，做菌液PCR也是如此，但是酶切就有条带）
可能就是模板出现的问题 看一下模板的量 不要太大
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7楼2008-09-12 11:21:00
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bihailantian

金虫 (初入文坛)
to 四楼yelitao1983  兄：
答1：扩出非特异性带极有可能是水有问题，重新换水在超净台内做PCR.（水换过了，昨天我用自己实验室和别的实验室的水都同时做对照，结果两份水对照均克隆出一条100bp，一条300bp条带,让人匪夷所思,今天重新作）
答2：菌液PCR本身就是一种极有可能失败的方法，建议做质粒PCR.(这个方法别的同学也刚建议了, 等转化成功了可以换这种方法.)
答3：极有可能是模板有问题，可能你的模板已经不是阳性克隆了(如果是针对问题里的3,3中克隆1.4K用的是DNA)
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8楼2008-09-12 11:32:24
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bihailantian

金虫 (初入文坛)
to 五楼xipha  ：

1、2、3、dNTP和酶是同一个厂家的么？如果不是，有可能扩不出来特异带或降低效率。也可能是10*Buffer坏了，建议换新的。：（是一个厂家的，并且重新换过新的了）
无论如何，根据陈述，应该是PCR体系出问题的可能性最大。（正在思考中）
建议做一个1.5kb左右的一定能扩出来的阳性PCR以确定是否如此。
2、既然PCR体系失败，当然扩不出来，双酶切的可能是杂带
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9楼2008-09-12 11:34:37
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bihailantian

金虫 (初入文坛)
我们实验室多人用一套移液器，所以我今天换了两只移液器，也做了几个对照，下午才能知道结果，谢谢大家。希望大家踊跃发言，呵呵
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10楼2008-09-12 11:38:43
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