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bihailantian金虫 (初入文坛)
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[交流]
急！急！急！！！出现了一个多月的克隆和转化问题，请大家帮帮忙！
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1.目的片断1.6k，8月上旬可任意扩增出来，近一个月在同样的体系.程序在同一台PCR仪的的情况下，扩不出目的片断（已经换过新的酶，dNTP,引物等）但是会出现非特异条带，且片断一般在700-1100左右。问题可能出在哪里？（这个问题在前面发的一个帖子里有） 2.用8月初回收的目标片断（1.6k）进行连接（宝生的PMD18-T和solution I）-转化(热激法)- 涂板（氨苄抗性的LB培养基）,37度培养过夜。 随后M13为引物做菌液PCR，看不到目的条带。但对同一个菌落-摇菌-提质粒-双酶切检测，部分菌落呈阳性。为什么菌液PCR检测不到已经转进去的片断？送去几批样品测序也总是失败，公司说没有信号。（7月底测过一次，序列是正确的。） 3.最近一个周克隆一个1.4k，也扩不出来。(8月上旬都可克隆出)，现在模板，引物，酶，dNTP，水等都换了新的，并且换到别的实验室做过也没有出来。今天相同的样品放在2个PCR仪里面，居然都是克隆出的200bp,500bp的两条带，为什么，这两个基因突然克隆不出？这两个基因持续克隆不出来都一个月了，实在想不出原因，请大家帮帮忙把。 [ Last edited by bihailantian on 2008-9-12 at 11:18 ] |
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zhouyj
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2楼2008-09-11 18:16:55
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3楼2008-09-11 19:16:24
4楼2008-09-11 19:46:52
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bihailantian(金币+1,VIP+0):是一个厂家的，全套试剂全部换过，包括模版，做了个另外的差不多大小的引物，也做不出来，真是头痛。但还是要谢谢您
bihailantian(金币+3,VIP+0):同上
bihailantian(金币+1,VIP+0):是一个厂家的，全套试剂全部换过，包括模版，做了个另外的差不多大小的引物，也做不出来，真是头痛。但还是要谢谢您
bihailantian(金币+3,VIP+0):同上
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1、2、3、dNTP和酶是同一个厂家的么？如果不是，有可能扩不出来特异带或降低效率。也可能是10*Buffer坏了，建议换新的。 无论如何，根据陈述，应该是PCR体系出问题的可能性最大。 建议做一个1.5kb左右的一定能扩出来的阳性PCR以确定是否如此。 2、既然PCR体系失败，当然扩不出来，双酶切的可能是杂带 [ Last edited by xipha on 2008-9-11 at 22:23 ] |
5楼2008-09-11 22:21:34
bihailantian
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to 二楼zhouyj兄， 1、可能是模板问题，模板反复冻隆有时候可能是降解，你可以试试换新的模板，稍微提高一下退火温度，万一不行就切胶回收吧（模版已重新提取，退火温度已作了梯度，但依旧克隆不出来） 2、如果菌落PCR程序没问题的话，就想不出原因啦，我曾经也出现过，只能重心连接转化了。（现在是扩增不出来，用以前回收的转化也不成功  ，转了几次，感受态也换了）3、同样检查模板，引物是否有问题，如果两个基因是用同一模板扩不出来的话，模板出问题可能性最大 （引物换了新的粉末，前天才稀释的） [ Last edited by bihailantian on 2008-9-12 at 11:17 ] |
6楼2008-09-12 11:13:53
bihailantian
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7楼2008-09-12 11:21:00
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8楼2008-09-12 11:32:24
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9楼2008-09-12 11:34:37
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10楼2008-09-12 11:38:43
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