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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助Northern blot 的问题
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blizzard1506

[交流] 求助Northern blot 的问题

最近做了几次northern，都失败了，膜上一片空白。我有几个问题想请教下大家。
1、电泳跑完后的转膜大家用得是什么方法？我是用得一沓纸巾压在膜上靠纸巾的吸附将RNA转到尼龙膜上，用20xSSC转膜过夜。但发现转膜效率不高，怀疑在转膜过程中膜上方的纸巾搭到了胶下的滤纸发生了短路。可是我每次搭建转移平台时都很小心，凝胶的四周也用保鲜膜封过，可转移效率还是不大好。不知大家有什么好的方法？？？
2、紫外交联用得是UVP的紫外交联仪2000型，总照射剂量为1.5 J/cm2，不知这样的剂量是否足够是RNA交联到尼龙膜上？？？
3、做northern时还需注意什么？？？
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1楼 2008-09-10 01:12:14
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shuchang

金虫 (初入文坛)
纸巾和膜之间加几张硬的滤纸，勤换纸巾
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2楼2008-09-10 02:47:55
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blizzard1506

尼龙膜的上方我加了两张3MM滤纸的。
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3楼2008-09-10 16:22:46
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
短路你挡住四个边是不会有问题的
紫外交联的化 我用的12000J
其他的就是起始RNA量要大 电泳时在冰箱中 探针要测序验证 同位素的量要够 洗膜的时候，不要把信号洗没
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4楼2008-09-10 18:52:57
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plantst5928

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你这是用的上行法转膜。转膜的时间没有必要这么长，要不然你的RNA都转过了。一般来说4-5h就可以了。
然后就是在洗膜的时候要注意检测信号的强弱，别洗过了，不然你显影就很淡了。
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5楼2009-08-17 22:45:52
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
短路是不可能的，对于那些溶液来说，几层纸啊海绵啊，不都是透明的一样么
你转完之后用EB染下胶看看有没有转过去
转过夜会不会导致RNA降解呢？这个需要考虑
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6楼2009-08-17 23:44:35
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