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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 基因敲除第一步同源重组后用上下游基因的两头引物同时扩增怎么只出现了一个条带
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小小八八

铁虫 (初入文坛)

[求助] 基因敲除第一步同源重组后用上下游基因的两头引物同时扩增怎么只出现了一个条带 已有2人参与

终于把基因组上缺失目地基因的上下游片段融合到一起了且连到敲除载体上，再把构建好的敲除载体导入我们的宿主菌，现在问题来了：
我们用的是两次同源重组的方法进行敲除的，第一轮同源重组后我用相应的抗性平板筛选到了照理说质粒整合到基因组上的转化子，提了转化子的基因组后然后我用我缺失了目地基因而融合在一起的上下游片段的两个外端的引物，可是p出来的条带只有少了目地片段的上下游基因的长度（大概2000左右），而没有上游引物+目地基因+下游基因的那个片段（大概2600左右），但是我的原始宿主菌的对照，它是可以p出2600这个全长的片段，这说明了什么？第一轮同源重组有没有成功？
1，如果成功了，为什么用上下游基因的上下游引物p，应该p出两条带，却只能p出一条带；
2，考虑到有可能目地基因已经敲除成功，昨天我把我从抗性平板上挑的基因提了基因组，p我的目地基因，结果目地基因能p出来，说明敲除没有成功，那么为什么我用上下游基因的引物p，p不出这个带有目地基因的全长片段？
以上，请问虫友们做敲除的有没有遇到这种情况，有什么办法可以确定我的菌已经进行了第一次同源重组呢？
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1楼 2015-10-30 09:00:29
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混合配搭

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小小八八 at 2015-11-08 14:36:48
没人知道吗？还是我说的不明白呢

你好，刚接触想问问基因敲除得具备什么条件啊？片段什么的是怎么找的啊？

发自小木虫IOS客户端
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3楼2015-12-17 22:33:35
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小小八八

铁虫 (初入文坛)
没人知道吗？还是我说的不明白呢
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2楼2015-11-08 14:36:48
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无忧丶94

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以增加引物对的量。一般PCR都是优先扩短片段
赞一下 回复此楼
4楼2015-12-23 17:14:33
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胡武佳

新虫 (小有名气)
延时时间长一点

发自小木虫Android客户端
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5楼2018-11-07 14:54:59
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