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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 大神帮忙看，SDS-PAGE检测此重组表达蛋白（酶）基本都在沉淀里，上清会否有酶活？
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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Stridegogogo

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小可爱

[求助] 大神帮忙看，SDS-PAGE检测此重组表达蛋白（酶）基本都在沉淀里，上清会否有酶活？ 已有4人参与

请大神帮我看看，第一条带是marker，第二三四条带分别是空载体的全菌上清沉淀，后三条带，分别是 重组蛋白破碎后的全菌 上清 沉淀。我感觉蛋白都在沉淀里，基本上清理完全没有，我表达的是一个酶，但是理论上上清里应该也是含有的啊，但是我没有检测到活性，大家遇到这种情况都是怎么做，用上清还是包涵体复性？

大神帮忙看，SDS-PAGE检测此重组表达蛋白（酶）基本都在沉淀里，上清会否有酶活？
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分子克隆与蛋白结晶
1楼 2015-10-16 23:55:36
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ls5940

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这张图说明你这个酶是胞内且不可溶或者包涵体过分表达。你用上清并不起任何作用。我建议你低温诱导，比如16度。这样有可能不会过分折叠。可能会出现在上清中。

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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
2楼2015-10-17 09:12:26
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Stridegogogo

捐助贵宾 (小有名气)

小可爱
引用回帖:
2楼: Originally posted by ls5940 at 2015-10-17 09:12:26
你这张图说明你这个酶是胞内且不可溶或者包涵体过分表达。你用上清并不起任何作用。我建议你低温诱导，比如16度。这样有可能不会过分折叠。可能会出现在上清中。

我就是16度低温诱导，表达了12个 有8个都是这种情况，测不出酶活，现在不能确定到底是酶本身就不能降解我们的那种底物，还是我的上清本身就不含有酶，肿么办
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分子克隆与蛋白结晶
3楼2015-10-17 14:38:36
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ls5940

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
Stridegogogo: 金币+5, ★有帮助 2015-10-20 11:54:36
换一个宿主细胞再试试。如果还是不行，就得尝试换载体，或者尝试包涵体复性吧。

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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
4楼2015-10-17 22:14:46
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穿白大褂约会

禁言 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
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5楼2015-10-17 22:23:51
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总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

其实也还好，包涵体易于分离，纯度还较高，就是回收具有生物活性的蛋白比较困难。可以看看前面的操作重组蛋白表达过程有没有加蛋白质折叠的辅助因子或者可能环境不适（温度过高、PH接近等电点）；一般表达量过高也会形成包涵体，可以减少重组菌培养的量，不行就包涵体复性。
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我好累，承受这个年纪不该有的帅！
6楼2015-10-20 11:25:05
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
换个有伴侣蛋白的载体试试
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7楼2015-10-20 13:12:50
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sonyangg

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

做个明胶酶谱，一看便知
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8楼2015-10-20 17:48:34
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Stridegogogo

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小可爱
引用回帖:
8楼: Originally posted by sonyangg at 2015-10-20 17:48:34
做个明胶酶谱，一看便知

你好 请问啥是凝胶酶谱

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分子克隆与蛋白结晶
9楼2015-10-22 19:15:43
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