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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求大神看下质粒双酶切图
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han3028730

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by jiangpozi at 2015-10-15 11:23:46
200bp marker 。buffer4 的下面较小的条带是800bp的 ，为什么有这么个条带呢？...

确认一下酶切位点是否唯一。
既然你的两个酶切位点只相聚20bp，那么不应该出现800bp的条带，出现了应该是内切酶在本不该作用的位置上作用，可能是buffer不合适导致星号活性。
考虑到这个因素，用buffer1的产物应该是目的产物了。
最好对照图谱和质粒的准确序列确认一下。
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11楼2015-10-15 20:01:01
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zyyyyyyy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶切位点只有20bp，电泳看不出来切没切开。可以快酶切2-3小时或者慢酶过夜切，保证切割。回收酶切的载体，连接你要的片段，然后转化，pcr检测。
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12楼2015-10-16 12:34:08
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云中子2014

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我看了你的图，照你提供的资料，第一可能片段内部还有你使用的酶切位点。第二，你是用的酶看看是不是有星号活性。另外重新跑一个阳性对照排除一下酶的问题。
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科研路上无坦途
13楼2015-10-16 19:47:01
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chenyhok1987

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议使用NEB公司的HF酶，很多通用BUFFER，而且也不用担心切得时间久而糊掉的，另外任何内切酶来切割都不能全部切点，切胶回收时候也可以让胶多跑一会，可以很好的线性分离回收，祝好~~~
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平生多磨砺，男儿自横行！
14楼2015-10-17 16:32:09
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jiangpozi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by EasternCocoo at 2015-10-15 16:01:19
用的marker不对啊，弄个大点的marker，还有理论上你切完应该得到多大的条带，你要分析下啊，用VectorNTI分析下，然后再对照胶图看下，就知道切开没有啊！

理论上只有酶切位点之间的20bp了
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15楼2015-10-22 13:38:28
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jiangpozi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by han3028730 at 2015-10-15 20:01:01
确认一下酶切位点是否唯一。
既然你的两个酶切位点只相聚20bp，那么不应该出现800bp的条带，出现了应该是内切酶在本不该作用的位置上作用，可能是buffer不合适导致星号活性。
考虑到这个因素，用buffer1的产物应 ...

质粒的酶切位点难道不是唯一的么？
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16楼2015-10-22 13:40:09
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科学小覃

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

为何酶切后的条带比未酶切的浓度低那么多，个人认为有可能浓度太低看不出来。
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生物科学
17楼2015-10-22 15:04:33
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