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han3028730

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by jiangpozi at 2015-10-15 11:23:46
200bp marker 。buffer4 的下面较小的条带是800bp的 ,为什么有这么个条带呢?...

确认一下酶切位点是否唯一。
既然你的两个酶切位点只相聚20bp,那么不应该出现800bp的条带,出现了应该是内切酶在本不该作用的位置上作用,可能是buffer不合适导致星号活性。
考虑到这个因素,用buffer1的产物应该是目的产物了。
最好对照图谱和质粒的准确序列确认一下。
11楼2015-10-15 20:01:01
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zyyyyyyy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
酶切位点只有20bp,电泳看不出来切没切开。可以快酶切2-3小时或者慢酶过夜切,保证切割。回收酶切的载体,连接你要的片段,然后转化,pcr检测。
12楼2015-10-16 12:34:08
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云中子2014

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我看了你的图,照你提供的资料,第一可能片段内部还有你使用的酶切位点。第二,你是用的酶看看是不是有星号活性。另外重新跑一个阳性对照排除一下酶的问题。
科研路上无坦途
13楼2015-10-16 19:47:01
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chenyhok1987

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议使用NEB公司的HF酶,很多通用BUFFER,而且也不用担心切得时间久而糊掉的,另外任何内切酶来切割都不能全部切点,切胶回收时候也可以让胶多跑一会,可以很好的线性分离回收,祝好~~~
平生多磨砺,男儿自横行!
14楼2015-10-17 16:32:09
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jiangpozi

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by EasternCocoo at 2015-10-15 16:01:19
用的marker不对啊,弄个大点的marker,还有理论上你切完应该得到多大的条带,你要分析下啊,用VectorNTI分析下,然后再对照胶图看下,就知道切开没有啊!

理论上只有酶切位点之间的20bp了
15楼2015-10-22 13:38:28
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jiangpozi

新虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by han3028730 at 2015-10-15 20:01:01
确认一下酶切位点是否唯一。
既然你的两个酶切位点只相聚20bp,那么不应该出现800bp的条带,出现了应该是内切酶在本不该作用的位置上作用,可能是buffer不合适导致星号活性。
考虑到这个因素,用buffer1的产物应 ...

质粒的酶切位点难道不是唯一的么?
16楼2015-10-22 13:40:09
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科学小覃

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

为何酶切后的条带比未酶切的浓度低那么多,个人认为有可能浓度太低看不出来。
生物科学
17楼2015-10-22 15:04:33
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