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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 请高手虫子帮我分析一下为什么GADHP跑成了这样？多谢
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蛋白小王子6

银虫 (小有名气)

[交流] 请高手虫子帮我分析一下为什么GADHP跑成了这样？多谢已有2人参与

各位虫友，
是这样的，本来二抗应该孵育一个小时， 我有点事情，就室温孵育完之后，4度又孵育了5个小时。然后我担心背景值太高，就洗了2个小时。结果GADPH 就发成了这样；
我有两个问题问问虫友。
1.粗的那个条带是GADPH，不过怎么曝光那么白？
2.下面那个发大很好的双带时怎么回事啊？
多谢虫友
顺祝
  台安
/Users/kangtianshu/Desktop/GADPH Ser-1.jpg

请高手虫子帮我分析一下为什么GADHP跑成了这样？多谢
GADPH Ser-1.jpg
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1楼2015-10-12 12:07:02
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314300420

捐助贵宾 (著名写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
蛋白小王子6: 金币+1 2015-10-14 00:19:37
蛋白小王子6: 金币+1, 戳中软肋，确实GADPH一抗为1:1500稀释。多谢多谢。 2015-10-14 00:20:40
一抗浓度太高了，提高稀释度就没问题了
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4楼2015-10-13 08:54:31
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
蛋白小王子6: 金币+4 2015-10-14 00:14:16
孵育时间过长导致底物过快消耗掉，所以不黑反白，在你刚加上去一两秒钟底物就消耗没了，
底下的条带是抗体非特异性结合的条带也有可能是少量降解造成，还是因为抗体孵育时间太长，把平时看不到或者比较浅的条带都显出来了
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
3楼2015-10-13 01:59:15
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普通回帖

蛋白小王子6

银虫 (小有名气)
不好意思 题目答错了 是GADPH
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读书也不必只读纸做的书，山水可以读，云雨可以读，官场可以读，商界可以读，赌徒和妓女也是书，只在家读书，读了书还是书，无异于整日喝酒、打牌和吸烟土。
2楼2015-10-12 12:08:15
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djbitter

新虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
蛋白小王子6: 金币+3 2015-10-14 00:27:09
从图上看，一是可能一抗浓度高，如果是这样，增加洗涤效果也不显著;二是上样量太大，条带粗。二抗如果特异性好，按你提供的方法，问题不会太大，我室温2－3h，也没增加背景。至于洗涤，二抗一般30－40分钟，做内参时更短。个人认为合适量，出来“sharp”的条带为宜。
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5楼2015-10-13 10:49:23
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yanzi0101

新虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
蛋白小王子6: 金币+1 2015-10-14 00:29:24
减少上样量试一下
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6楼2015-10-13 18:45:45
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蛋白小王子6

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-10-13 01:59:15
孵育时间过长导致底物过快消耗掉，所以不黑反白，在你刚加上去一两秒钟底物就消耗没了，
底下的条带是抗体非特异性结合的条带也有可能是少量降解造成，还是因为抗体孵育时间太长，把平时看不到或者比较浅的条带都显 ...

谢谢你解释了困扰我的不黑反白的实验结果。是的的确是蛋白上样量为足量的30ug。我的DADPH一抗浓度为1:1500稀释的 然后二抗有孵育了室温1hour+4度 5小时。可能是非特异性的带也染出来了。
多谢多谢帮助。

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7楼2015-10-14 00:18:48
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银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by djbitter at 2015-10-13 10:49:23
从图上看，一是可能一抗浓度高，如果是这样，增加洗涤效果也不显著;二是上样量太大，条带粗。二抗如果特异性好，按你提供的方法，问题不会太大，我室温2－3h，也没增加背景。至于洗涤，二抗一般30－40分钟，做内参时 ...

多谢你的意见。我想问一下什么标准才是Sharp型的条带

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8楼2015-10-14 00:28:55
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银虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by yanzi0101 at 2015-10-13 18:45:45
减少上样量试一下

我是1mm 15孔的薄板，上样量是30ug。半干转。话说转转完之后，胶上还有marker。估计目的蛋白可能也在。但是这次结果90KD目的蛋白什么都没发出来。是不是半干转的不适合90KD蛋白，还是我没有找到好条件？

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9楼2015-10-14 00:33:02
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银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 314300420 at 2015-10-13 08:54:31
一抗浓度太高了，提高稀释度就没问题了

戳中软肋，确实GADPH一抗为1:1500稀释。多谢多谢。

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10楼2015-10-14 00:33:57
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